DLLME—TLC快速检测血、尿中有机磷农药

滕军

(贵阳医学院公共卫生学院，贵州 贵阳 550004)

有机磷杀虫药(organophosphorus pesticides，OP)是一种杀虫效力强、对植物药害较小的人工合成有机磷酸酯类化合物，在我国农村被广泛运用。但因大量和不科学使用，其中毒事件时有发生。目前，常见的有机磷农药快速测定方法有：光谱法、免疫分析法、酶抑制法和生物传感器技术[1～3]等。血、尿中有机磷农药提取常用方法有：液-液萃取和固相萃取[4～6]两种方法。近年来发展了顶空固相微萃取[7]技术。这些方法都存在操作繁琐，耗时长或需要使用大量对人体有毒有害、引起环境污染的有机溶剂。Rezaee等于2006年首次报道了分散液-液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME) 技 术 。DLLME用于血、尿中有机磷农药的提取在国内还未见报道。本实验应用DLLME与薄层色谱法[8](thin layer chromatography,TLC)技术相结合，建立了血、尿中敌敌畏、乐果、马拉硫磷和乙基对硫磷4种有机磷农药的快速定性方法。本方法不需要特殊装置和昂贵大型仪器设备，便于在基层推广，适于对样品进行快速初步筛查。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 XW-80A型漩涡混合器(江苏海门麒麟医用仪器厂)，AR1530/C型电子天平 (美国OHAUS CORP)，硅胶板(青岛海洋化工厂分厂)；乐果标样由国家农药质检中心提供，含量≥99.0%；敌敌畏、马拉硫磷、乙基对硫磷均由天津农药股份有限公司提供，上述4种农药均用丙酮配制成浓度为10mg/ml或20mg/ml的储备液，在冰箱中保存，临用时用丙酮稀释成浓度为1mg/ml标准应用液。

显色剂：溴酚蓝-醋酸试剂、间苯二酚-氢氧化钠试剂

展开剂：三氯甲烷-丙酮(4:1)、苯-石油醚-丙酮(7:2:1)

丙酮、三氯甲烷、苯、石油醚、无水乙醇、溴酚蓝、醋酸、间苯二酚、氢氧化钠、硝酸银等均为分析纯，实验用水为MilliQ超纯水。

1.2 方法

1.2 .1尿液中农药提取 取两份5m l尿液于2支10m l具塞比色管中，分别加入1ml分散剂丙酮，混匀，再加入80μl萃取剂三氯甲烷，小心振摇2min，静置1min，吸弃上层尿液，用玻璃毛细管吸取管底部的萃取剂三氯甲烷进行定性分析。

1.2 .2血液中农药提取 称取两份全血(血块捣碎)各5g放于50ml烧杯中，分别加入5ml纯水，1ml丙酮，在漩涡混合器上混合30s，将上层液体转入2支10m l具塞比色管中，各加入80μl三氯甲烷，小心振摇2min，静置1min，吸弃上层液体，剩余的萃取剂转入2个10ml小烧杯中，于小烧杯中加入0.2～0.4g无水硫酸钠，拌匀，再加入80μl三氯甲烷反提，稍候，待反提剂浓缩至10～20μl即可用于定性分析。

1.2 .3定性 按GA/T101-1995[8]中薄层色谱法进行定性分析。将两份平行样品农药提取剂分别点样于两块硅胶板上，并在两块板上点上相应的几种农药标准液，然后分别在两种展开剂中展开，取出，挥干展开剂，进行显色。含硫有机磷农药用溴酚蓝-醋酸试剂显色，敌敌畏用间苯二酚-氢氧化钠试剂显色。最后将样品斑点与标准斑点进行比较，根据斑点Rf值大小定性，斑点颜色深浅和大小半定量。

2 结果

2.1 检出限 本实验用健康人尿添加农药标准，测得4种有机磷农药尿液中检出限为 2μg/ml；用血(未添加任何试剂)添加农药标准，测得4种有机磷农药血中检出限为6μg/ml。

2.2 萃取剂及其体积的选择 为了便于提取，实验要求萃取剂比重要大于样品溶液的比重，且对农药的溶解力强，基于这两点，本实验可选用的萃取剂有二氯甲烷与三氯甲烷，因三氯甲烷的比重较大(1.471～1.485g/ml)，所以本实验选用三氯甲烷作为萃取剂。 萃取剂体积分别考察了 50μl、60μl、80μl、100μl对样液萃取效果的影响，实验表明萃取剂为80μl萃取效果较好，如果体积大于80μl，会稀释所要提取的农药，所以本实验选用80μl。

2.3 分散剂及其体积的选择 分散剂的作用是使溶液中有机物很好地分散，便于农药提取，同时利于萃取剂沉淀于容器底部。本实验考察了甲醇、乙醇、丙酮的萃取效果，实验结果表明，丙酮的萃取效果最好，所以选择丙酮作为分散剂。实验中分别用体积为 0.5ml、1.0ml、1.5ml的丙酮考察萃取效果，丙酮体积为1.0ml时即能很好的提取样液中农药，所以选用丙酮体积为1.0ml。

2.4 萃取时间的选择 样液中加入分散剂和萃取剂后，振摇时间分别考察了 1min、2min、3min，实验结果表明，萃取效率随时间增加而提高，2min后萃取效率改变不明显，故本实验选择萃取时间为2min。

2.5 盐的影响 本实验考察了氯化钠、无水硫酸钠对萃取效果的影响。实验结果表明，加入盐后，萃取剂不易提取。故本实验萃取时不加盐。

3 讨论

有机磷农药对成人口服致死量 敌敌畏10～14g(25%乳剂)、乐果2g、马拉硫磷60g、乙基对硫磷0.1～0.3g；有机磷农药进入机体后，能迅速被吸收代谢，排出速度较快，一般在24h内经尿排出，少量从肺呼出和粪便排出。口服后6～12h血液中浓度达高峰，由于血液中的胆碱酯酶能迅速水解有机磷农药，如果农药进入机体时间较长，血液中则不易检出原药，因此，采样应在血液中农药浓度达到高峰时段进行。在血液的存放过程中，有机磷农药降解速度较快，所以血样的存放时间不宜过长，采血后应立即检测，如果需要保存，应低温冷冻保存，并避免与碱性物质接触。在血样和尿样中如果未检出原药，应进一步检测样品中农药代谢物，以确定是否有机磷农药中毒。临床毒物分析判断病人是否有机磷农药中毒的方法多采用测定血液中胆碱酯酶活性，这种方法不能判断病人是哪一种农药中毒，从而影响治疗方案的确定。传统的分析方法耗时太长，不利于急性中毒病人的救治，因此，建立血、尿中有机磷农药原药或代谢物的快速检测方法具有重要意义。

[1]王 华,熊汉国,潘家荣,等.有机磷农药残留快速检测方法研究进展[J].中国公共卫生,2007(04):500～501.

[2]孙永海,王智赟,王 喆,等.有机磷农药残留快速检测方法[J].农机化研究,2008(07):161～162,165.

[3]刘晓宇,李爱芳,陈 明,等.蔬菜中有机磷农药辛硫磷的化学发光分析研究[J].分析化学研究简报,2007,35(12):1809～1812.

[4]贺浪冲主编.法医毒物分析[M].第3版,北京:人民卫生出版社,2004:159～171.

[5]陈昆山,曾昭书主编.法医检验技术[M].北京:海洋出版社,2007:288～297.

[6]Hajslova J,Zrostlikova J.Matrix effects in(ultra)trace analysis of pesticide residues in food and bioticmatrices[J].J Chromatogr A,2003,1000(1):181～197.

[7]Hernandez F,Pitarch E,Beltan J.Headspace solid-phasemicroextraction in combination with gas chromatography and tandem mass spectrometry for the determination of organochlorine and organophosphorus pesticides in whole human blood[J].JChromatogr Biomed Appl,2002,769:65～77.

[8]徐 婉,赵敬真,等.GA/T101-1995,中毒检材中有机磷农药的定性定量分析方法[S].北京:中国标准出版社,1995:1～13.