RQ-PCR技术检测白血病融合基因及其临床应用

江 梅综述，万腊根审校

(南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006)

实时荧光定量PCR技术 (real time quantitative PCR，RQ-PCR)是由美国ABI公司于1995年研发用于核酸定量检测技术，目前该技术在科研和临床上已得到了广泛的应用，也为白血病的分子生物学研究提供了新的手段，已有很多临床血液病学家和检验学家应用该技术在白血病融合基因检测及其临床应用进行了大量的研究报道，本文拟就国内外的相关研究报道对检测白血病融合基因的RQ-PCR技术作一综述。

1 白血病融合基因

多数白血病患者具有特异性染色体异常：如急性早幼粒细胞白血病 (APL)、慢性粒细胞白血病(CML)等，由于染色体易位、倒位等变异，使得基因结构重排而产生融合基因，而成为白血病特异性的分子标志，因此对融合基因的检测可用于白血病的分子生物学分型诊断、预后观察及微残留病灶(MRD)的诊断，目前常见于临床的白血病融合基因有以下几种[1-2]。

1.1 bcr-abl融合基因：是由 t(9；22)(q34；q11)，使9q34上的原癌基因abl与22q11上的bcr基因合并形成bcr-abl融合基因，并转录产生8.5kb的融合mRNA。染色体易位时abl基因的断裂点位于第二外显子 (a2)(实际是从第1内含子到第2内含子间＞100kb的区域)，断裂点相对比较固定，bcr基因的断裂点有三个，在CML集中于中部第12～15外显子和相应内含子长约5.8kb的M-bcr区，且主要在第13(b2)和第14(b3)外显子断裂形成b2a2和b3a2亚型；第三个断裂点位于第1内含子中2个较小的bcr-1或bcr-2区形成m-bcr/abl融合基因 (e1a2亚型)，b2a2，b3a2和 e1a2分别编码 P210、P210和 P190蛋白，文献[3]报道 100%CML病人检出 bcr/abl，因此bcr-abl融合基因检测可用于CML的分子诊断。

1.2 PML-RARa融合基因：是由于 t(15，17)(q22；q22)染色体易位，使17号染色体上的RARa基因与位于15号染色体上的PML基因融合后形成的PML-RARa融合基因，PARa仅一个断裂点位于2号内含子，PML基因有3个断裂点，分别位于6号外显子、6号内含子和3号内含子，形成Long(55%)、Varint(5%)和 Short(40%)三个亚型。PML-RARa融合基因是APL的特异性分子标志，见于98%的APL病人[3]。因此PML-RARa基因检测可用于APL分子诊断。

1.3 AML1-ETO 融合基因：t(8；21)(q22；q22)易位，使位于22q22的AML1基因在5号内含子处断裂与位于8q22的ETO基因在2号外显子处断裂后融合形成AML1-ETO融合基因，AML1-ETO融合基因主要发生于M2的白血病中，文献[3]报道阳性率达90%，可作为M2b诊断的重要分子标志，也可用于其它AML如M1、M4、M5的分子分型诊断，且其阳性时预后良好，完全缓解率高达98%，5年存活率达67%。因此AML1-ETO融合基因的检测可作为M2b和部分其它AML诊断、预后观察及MRD诊断的分子标志。

1.4 CBFβ—MYH11融合基因：是由于inv(16)(p13；q22)，使位于16q22的CBFβ基因在5号外显子处断裂，与位于16p13的MYH11基因在12号外显子(A)或8号外显子(D)或7号外显子(E)断裂点断裂而形成约10个亚型的CBFβ-MYH11融合基因，其中A亚型占88%、D亚型占5%、E亚型占5%，文献[3]报道M4EO病人CBFβ-MYH11融合基因阳性率达85.7%，且CBFβ-MYH11阳性者预后好。因此CBFβ-MYH11融合基因可作为M4EO诊断、疗效观察及MRD诊断的分子标志。

1.5 TEL/AML1融合基因：t(12；21)(p13；q22)的易位使位于12p13的TEL基因在5号内含子处断裂与位于21q22的AML基因在1号内含子或2号外显子处断裂而形成TEL/AML1融合基因，是儿童前B-ALL最常见的染色体异常之一，其阳性率可达20～25%[4]，其阳性表达预后较好，因此TEL/AML1融合基因可作为ALL诊断、疗效观察及MRD诊断的分子标志。

1.6 E2A/PBX1 融合基因：t(1；19)(q13；p22)易位使位于1q13的PBX1基因在1～3号外显子之间断裂与位于19 p22的E2A基因在13-14号外显子之间断裂而融合形成E2A/PBX1融合基因，见于5%左右的儿童ALL，在B-ALL中占 20～25%[5]，但其阳性与预后关系不明显，但是可作为ALL及MRD诊断的分子标志。

1.7 MLL重排形成的基因：MLL基因位于11q23，白血病时MLL基因会发生重排，形成融合基因如t(11；4)(q23；q21)的易位，使位于 11q23 的 MLL 基因于8～12号外显子之间断裂与位于4q21的AF4基因在3～7号外显子之间断裂后融合，形成MLL/AF4融合基因。 还有 t(9；11)(p21-22；q23)形成 MLL-AF9融合基因；t(11；19)(q22；p13)形成 MLL-ENL 融合基因。95%MLL-AF4融合基因多见于ALL，MLL-AF9见于86%的AML中的M5型，成熟MLL-ENL几乎全为AML[6]。

1.8 其它融合基因：随着白血病分子生物学研究的深入，将有新的异常核型或新的融合基因发现，如DEK-CAN、AML1-MIG8、PLZE-RARa融合基因等，它们均将成为白血病分子诊断、预后判断及MRD诊断的分子标志。

2 RQ-PCR技术

RQ-PCR技术是在常规PCR基础上加入荧光染料或荧光标记探针然后通过荧光定量PCR仪检测PCR过程中荧光强度的变化，达到对样品靶序列进行定量检测的目的，目前用于白血病融合基因定量检测的RQ-PCR技术有以下几种。

2.1 DNA结合染料技术：是在PCR反应体系中加入SYBRGreenI荧光染料，因为该荧光染料能与双链DNA结合，产生强烈荧光，在PCR过程中，随着扩增产物DNA分子的增多，结合的SYBRGreenI也增多，荧光信号与扩增产物DNA的含量成正比，因此用荧光定量PCR仪检测PCR过程中延伸期的SYBRGreenI荧光强度(在每个循环的延伸期完成后检测)，可对样品的靶序列(或基因)进行定量检测。但是由于SYBRGreenI能与任何DNA结合，即也能与PCR反应体系中的非特异的dsDNA，如引物二聚体结合，使PCR反应体系中的荧光本底偏高，但可通过用有熔解曲线分析软件的PCR加以解决[7]。

2.2 Taqman水解探针技术：它是在PCR反应体系中设计一条荧光素标记的探针，在探针的5’端和3’端分别标记荧光报告基团R和荧光淬灭基团Q，探针完整时Q基团会抑制R基团不能发射荧光，而TaqmanDNA聚合酶即有沿着模板移动合成DNA新链又具有5’-3’外切核酸酶活性，能逐个水解探针上的脱氧核甘酸，使得R基团与Q基团分离，R基团便可发射荧光，因此在PCR过程中，随着DNA扩增，R基团产生的荧光信号逐渐增强，因而PCR仪可通过检测荧光强度 (在每个循环的延伸过程中检测)，便可推算出初始靶序列的拷贝数[8]。这是目前RQ-PCR应用最多的检测技术。

2.3 杂交探针技术：它是利用荧光共振能量转移的原理，在PCR反应体系中设计两条探针，探针A上标记荧光供体基团，探针B上标记荧光受体基团，两探针与靶序列杂交时，两探针是以头尾方式杂交于靶序列上，其间距在1～5个bp，这时便产生荧光，在PCR反应过程中，随着靶序列的扩增，与靶序列杂交的探针增多，荧光强度也增强，这样荧光强度与PCR反应中的DNA量成正比，因而PCR仪便可通过检测荧光强度计算出初始靶序列的拷贝数[9]。

3 RQ-PCR检测白血病融合基因检测方法及分析性能

3.1 RQ-PCR检测白血病融合基因的方法：

参阅国内外文献，应用RQ-PCR检测白血病融合基因，其实都是检测其RNA的表达，大多采用的是Taqman水解探针、杂交探针及DNA染料的结合的RQ-PCR技术，其中使用最多的为水解探针技术，各检测技术虽然在原理上有差异，但其使用的仪器(实时荧光定量PCR仪)和建立的检测方法大同小异，具体方法或操作流程如下。

3.1.1 制备目的基因和管家基因的RNA标准品：目的基因的RNA标准品文献报道[10]采用提取、回收纯化目的基因后再行分子克隆和体外转录，得到转录产物后再进行抽提、精制，测吸光度(A)值，根据阿佛加德常数(6.02×1023copies/mol)换算成目的基因分子拷贝数。制定标准曲线时对目的基因进行梯度稀释得到目的基因不同浓度的标准品。管家基因的RNA标准品大多是采用提取、回收纯化再进行体外转录得到管家基因的标准品。

3.1.2 样品RNA的提取：由于RQ-PCR测定的是融合基因RNA的表达量，因此要对样品(骨髓液或外周血)中的有核细胞进行RNA的提取，RNA的提取采用的是常规RNA提取和纯化精制的方法。

3.1.3 RNA的逆转录：由于RQ-PCR仪是对RNA进行定量测定，所以对融合基因RNA定量时，首先要对RNA进行逆转录成cDNA后再进行定量。

3.1.4 PCR扩增定量：对逆转录后的融合基因和管家基因cDNA；阳性对照，阴性对照及融合基因和管家基因标准品在荧光定量PCR仪上进行扩增，由计算机自动将样品与标准曲线进行比对换算出目的融合基因和管家基因的拷贝数。

3.1.5 结果报告：由于RQ-PCR是检测目的基因RNA的表达量，因此不同的样品即使反应起始时使用相同的RNA量，由于细胞来源不同，RNA的总表达量并非一致，进行表达量比较的不是RNA量相同，而是相同细胞数的RNA最重要，但要将样品统一到相同细胞数进行提取非常困难而且不能保证提取效率，所以需采用内对照，使用管家基因进行校正[10]。为此目前融合基因RNA表达量的结果报告有多种方式：①报告目的基因的对数值(lg)：首先从管家基因abl的定量结果求出RNA的误差，然后将目的基因PML-RARa的定量结果进行校正，由校正后的定量结果，再计算出样品之间的对数值，最后得出目的基因PML-RARa的对数值，再进行对数转换[10]。②报告目的基因的拷贝数：考虑到各样本总RNA浓度的差异，最终计算结果按下列公式换算：A(拷贝数/μg 总 RNA)=B(拷贝数/μl cDNA)÷OD260×1.05，A值即为统计的最终需要的数值[11]。③报告目的基因相对于管家基因的比值：考虑到每个样品总RNA浓度可能存在差异，以管家基因表达作为内参照，结果以目的基因的拷贝数与管家基因的拷贝数的比值乘以104来表示[12]，选用各种细胞中表达量较恒定的β-actin基因为参照基因且结果以bcl/abl拷贝数/β-actin拷贝数表示，使之更加标准化[13]。④直接报告RNA基因的拷贝数/L：如邢秀华作者的“白血病bcr/abl mRNA的荧光定量RT-PCR检测”的研究，就是以bcr/abl基因表达的拷贝数(基因拷贝/L)报告结果的[14]。

3.2 RQ-PCR检测白血病融合基因的分析性能

3.2.1 目的基因标准品反应性能：RQ-PCR要对目的基因和管家基因进行定量必须检测其标准品，制定标准曲线，只有具有良好的线性关系，才能推算出正确的检验结果，目的基因和管家基因的标准品都是提取纯化，分子克隆和体外转录得到的精制RNA 标准品。大多文献报道[10，15，16]RQ-PCR 检测目的基因和管家基因的RNA标准品的拷贝数与Ct值相关性好，回归系数多在0.998以上，且具有良好的线性关系，因此为病人样品目的基因的检测提供了准确度保证。

3.2.2 灵敏度：RQ-PCR作融合基因检验时其灵敏度可达到 1×101拷贝[17-18]。

3.2.3 线性范围：文献报道[18]，在 102～106拷贝/ul的范围内重复性好，CV为1.91%，说明线性范围宽，符合临床检测要求。

3.2.4 特异性和精密度，姜艳梅作者[16]在应用RQ-PCR检测急性髓系白血病AML1/ETO融合基因时，对RQ-PCR进行了方法学评价，结果显示6例AML1/ETO融合基因阴性的标本均为阴性，说明特异性好。同一样本同一批内检测10次，其批内变异为6%；同一样本在每次实验时进行检测，其批间变异为10%，具有良好的精密度和特异度。

4 RQ-PCR检测白血病融合基因的临床意义

融合基因的检测方法很多，有染色体显带核型分析、荧光原位杂交(FISH)及PCR技术，Uckun[19]等分别用常规细胞核型分析、常规PCR以及巢式RTPCR的方法检测ALL患儿的t(4；11)易位时发现，PCR比细胞核型分析敏感，而巢式RT-PCR敏感性又是常规PCR的100倍，而RQ-PCR的敏感度具有巢式RT-PCR的敏感性，又是定量分析。因此更具有临床应用价值：

4.1 用于白血病分子诊断和疗效观察：很多融合基因如PAML/RAPa是某些白血病的特异性的标志，因而可作为白血病的分子诊断标志，同时文献[15]报道APL初诊组、CR组和复发组的目的基因(PML/RARa)的水平差异较大，初诊组的对数值较高，CR组较低，复发组又增高。说明RQ-PCR检测融合基因可作为白血病诊断、化疗完全缓解(CR)及复发的观察指标。

4.2 从分子水平确定完全缓解的新标准：目前以细胞形态学作为白血病临床缓解的标准已不能适用于临床，随着RQ-PCR临床上的应用，可使临床医师进一步了解白血病患者缓解后体内的白血病细胞的动力学特性，获得一个从分子水平确定的完全缓解的新标准从而能够对临床治疗反应作出正确评价，及时调整治疗方案，减轻患者经济负担同时减少不必要的化疗造成的痛苦[10]。

4.3 MRD诊断：MRD是导致白血病复发的主要原因[20]，常规细胞遗传学研究检测MRD的敏感性很有限(＜10-2)，FISH 的敏感性也不高(＜10-3)，而且如MRD水平很低时又很难与背景区别，目前就临床而言，对于染色体重排明确的白血病患者MRD重要检测手段是定性PCR技术，灵敏度可达到10-4～10-6[21]，MRD的动态定量变化则对预示复发是有肯定意义，比定性PCR更有意义[22]。因此RQ-PCR用于动态监测MRD应成为可行的常规检查。

综上所述，RQ-PCR作为一项新的检验技术其定量检测白血病融合基因具有良好的分析性能。虽然存在操作过程复杂，检测RNA时干扰和影响因素多，结果报告不统一以及存在对某一融合基因而言覆盖仍不够广泛等不足。但随着对RQ-PCR定量检测各种融合基因及其临床应用研究的深入，同时随着该技术的成熟和用于临床检验的标准化，以及越来越多的特异性融合基因被识别，RQ-PCR检验技术必将常规应用于白血病的分子诊断、预后观察和MRD诊断。

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