造礁石珊瑚的分子系统学研究进展

尤丰，黄晖，董志军，周国伟

（1. 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广东 广州 510301；2. 中国科学院研究生院，北京 10039；3. 中国科学院海南热带海洋生物实验站，海南 三亚 572000）

造礁石珊瑚的分子系统学研究进展

尤丰1,2,3，黄晖1,3，董志军1，周国伟1,2,3

（1. 中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广东 广州 510301；2. 中国科学院研究生院，北京 10039；3. 中国科学院海南热带海洋生物实验站，海南 三亚 572000）

综述了造礁石珊瑚系统发生关系和分类的研究现状，重点概述了造礁石珊瑚的分类和遗传多样性在分子生物学领域的研究进展。目前采用的进行造礁石珊瑚分类和遗传多样性研究的分子生物学方法，主要弥补了造礁石珊瑚在传统形态分类学上无法准确界定的缺点，其中核糖体RNA和线粒体DNA序列分析是目前对造礁石珊瑚分子进化和系统发育研究最有效的方法。最后，对未来造礁石珊瑚的分类和遗传多样性研究做了展望，对珊瑚礁框架生物造礁石珊瑚进行分类和遗传多样性的研究，将有助于为珊瑚礁生态系统的保护和恢复提供理论基础。

线粒体DNA；核糖体RNA；造礁石珊瑚；生物分类；遗传多样性

珊瑚礁生态系统是地球上多样性程度最高的生态系统之一，为超过25%的海洋生物提供栖息场所，其中造礁石珊瑚是珊瑚礁生态系的最主要贡献者和珊瑚礁的框架生物。因此了解造礁石珊瑚的系统分类，将有助于对珊瑚礁生物多样性的了解，为珊瑚礁的保护和管理提供理论参考。石珊瑚属于腔肠动物门（Cnidaria），珊瑚虫纲（Anthozoa），六放珊瑚亚纲（Hexocorallia），石珊瑚目（Scleractinia）。石珊瑚是唯一能形成石灰质外骨骼的珊瑚虫动物（Brusca 1990）。按照石珊瑚的生态特性，石珊瑚可以分为造礁石珊瑚（hermatypic corals）和非造礁石珊瑚（ahermatypic corals）。造礁石珊瑚指珊瑚虫体内有虫黄藻（zooxanthellae）共生的具有造礁能力（reef-building）的石珊瑚。非造礁石珊瑚是指不具备造礁能力（non-reef-building）的石珊瑚[1]。

造礁石珊瑚在不同层次上的多样性一直是许多研究的主题。生物形态学性状从17世纪起就被应用于解决系统发生问题，并一直是重建地球上绝大多数物种间亲缘关系的唯一依据。系统学是生物分类学和生物间各种关系（遗传关系、系统发育关系和地理分布关系等的总和[2]。

石珊瑚最早出现在大约2.4亿年前的三叠纪中期。经过长期海平面的改变和各大陆板块飘移等地质事件[3]，现生属甚至现生种的珊瑚可能在约2 400万年前的中新世就已形成[4]。因此，中新世以后的地质变化在现代造礁珊瑚的物种形成过程中扮演着重要的角色，此时典型的大西洋、印度洋和太平洋的珊瑚礁群已形成，就在大约中新世中期北移的非洲陆块切断西古海洋连结大西洋和太平洋的通路，使得地中海的造礁石珊瑚灭绝，同时古海洋通路的关闭也造成大西洋和印度-太平洋珊瑚礁生物地理区独立的发展[5]。到中新世的末期，巴拿马地峡逐渐形成，开始限制太平洋和加勒比海的通路，直到上新世巴拿马地峡完全关闭，印度太平洋和大西洋珊瑚则完全隔离[3,5]；与此同时，澳洲东北部的大堡礁形成。至于始新世所发生的冰河及之后冰解后海平面变动对石珊瑚种化的影响仍不清楚[4]。因此通过地质学和化石标本研究造礁石珊瑚不能十分明确了解其进化过程和进化关系。

20世纪60年代以来，分子生物学的不断发展为分析大范围内的不同水平的分类系统发生提供了可能[6,7]。相对于形态学性状而言，分子性状不仅是前者的补充，而且具有许多前者无法比拟的优点，比如DNA作为遗传信息的直接载体能较准确地反映生物类群之间的系统发生关系，具有信息量巨大、易于定量化和进行计算机分析等特点。就涉及多细胞动物起源与进化的分子系统学研究来说，一般是分析在生物进化中较为保守的DNA序列，主要包括单拷贝的蛋白质编码基因，少数线粒体DNA基因和少数核糖体RNA基因等。其中使用最为广泛的是18S rDNA基因，18S rDNA基因的核苷酸替换率较低，被认为最有希望成为解决早期动物进化型式的工具[6]。在用于重建系统发生史的信息中，分子数据所占的份额逐渐增加，发展成为系统学研究的一项重要性状。进入90年代以来，分子进化研究已经成为进化研究的热点之一。近年来，DNA测序主导了分子系统发生研究，因此本文就利用造礁石珊瑚核酸序列所做的分子系统发生研究作重点扼要的介绍。

1 造礁石珊瑚系统发育学分子生物学研究方法

自20世纪90年代，分子生物学技术在探讨造礁石珊瑚系统发育学方面得到大量的应用。目前用于分子系统发育学研究的主要方法有核糖体RNA和线粒体DNA序列分析。

1.1 核糖体RNA（Ribosome RNA）

rRNA基因是结构保守、进化速度缓慢的一种具有记录生物进化历史的特征分子，以其为分类依据建立的系统发育分类系统与生物的遗传结构有关，因此，rRNA基因分析在生物分类中普遍应用[1]。真核生物核糖体DNA由随机重复片段构成，其中包含ETS序列、SSU rRNA序列、ITS1序列、5.8S rDNA基因、ITS2序列和LSU rRNA序列等。核糖体DNA随机重复片段中编码基因和基因片段的多样性程度不同，但具有一致的进化速率，因此为较宽水平（从门到种群）的系统发生提供了可能性。目前运用核糖体RNA（Ribosome RNA）研究石珊瑚的系统发生关系主要是应用核糖体18S rRNA、5.8S rRNA以及内转录间隔区（Internal transcribed spacers, ITS）等进行[8]。同时这些分子标记也都适合六放珊瑚亚纲和珊瑚虫纲的系统发生关系的研究。

1.2 线粒体DNA（mtDNA）

目前在分子研究水平采用的另外一个遗传标记是mtDNA。由于mtDNA具有基因组结构相对简单和稳定、遵守严格的母系遗传、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，使其成为分子群体遗传学和分子系统学研究的重要标记[4]。mtDNA的基因组结构虽然十分保守，但是核苷酸序列的进化却十分活跃，其速率是典型单拷贝基因核DNA的5～10倍。由于其进化快速和一级结构高度歧化的特点，自20世纪80年代以来，mtDNA已成为研究近缘种间及种内群体遗传分化的有力工具[7]。在石珊瑚分子系统发生研究中，应用得最多的线粒体DNA信息是12S rRNA基因、16S rRNA基因和细胞色素b（cytochromeb, cyt b）基因，此外还有以细胞色素c氧化酶亚基I基因（COI）作为分子标记的研究[8]。

2 造礁石珊瑚的分子系统学研究研究内容和进展

2.1 造礁石珊瑚种群遗传多样性的研究

遗传多样性是生物多样性的重要部分之一，狭义上可以理解为种内不同种群之间或一个种群内不同个体之间的遗传变异的总和[9]。就是利用分子标记的方法研究石珊瑚种内各种群的遗传多样性，探讨物种形成和分化的机制。McMillan等使用核酸杂交的方法研究七种鹿角珊瑚MboI同源重复序列的多样性，以用于研究鹿角珊瑚属的分类关系。但序列分析结果显示的分类关系不同于形态学结果，存在很大的争议[10,11]。Smith和Chen等1997年设计一组位于珊瑚核糖体IGS序列的分子标记并应用RFLP技术分析了28个来自同一地点的样品，结果它们之中有17个不同的基因型，表明同一地点的某些同种石珊瑚也存在较高的基因多样性[12]。Odorico和Miller在1997年以分子标记ITS和5.8S rDNA研究分析五种鹿角珊瑚的多样性用于揭示鹿角珊瑚的进化的模式，结果发现鹿角珊瑚的ITS序列在所有已测序的后口动物中是最短的，但ITS序列仍然是高度多样性[13]。Romano等在1997年对石珊瑚14个珊瑚属的16S rRNA遗传多样性进行研究发现这段序列的多样性较低于其他后口动物，16S rRNA尽管可以用于属分类但是由于多样性的不高，所以不适合作为更具体阶元的分类标记[14]。Takabayashi等在1998年用石珊瑚特有的ITS引物对7种不同属的珊瑚进行了多样性的研究，发现这一段序列对于每种珊瑚都有极高的多样性并且不同种的ITS序列长度不一，同时发现在同一泻湖中Acropora Longicyathusi的ITS序列的多样性非常高，由此说明ITS序列不仅可以做种间的基因多样性研究而且可以做种内的基因多样性研究[15]。Oppen等在1998年研究鹿角珊瑚属线粒体DNA细胞色素b多样性时，就发现其进化速率明显慢于其他后口生物，并且发现加勒比海的鹿角珊瑚和太平洋的鹿角珊瑚的细胞色素b进化速率基本相同，但进化时钟比一般生物慢20多倍，这也许是由于腔肠动物门的错配修复能力较好[16]。根据上面所提及的，不同分子标记方法在研究石珊瑚种内遗传多样性和进化关系的研究结果存在一定的差异，这就有必要根据实际研究对象和研究内容来合理的选择更加有效的方法进行珊瑚分子生物学的研究，只有方法正确才得出合理有效的结果。

最近对于石珊瑚的研究有了新的进展，在2000年以后很多新的分子标记被引入石珊瑚多样性的研究。Chen等研究鹿角珊瑚线粒体DNA中的SSUrRNA序列，根据该序列的多样性可以用于估计进化速率和分歧的时间[17]。Maier等在2001年对箭排孔珊瑚构建了微卫星基因文库，发现5个微卫星多态位点，表明微卫星标记的方法可以应用于珊瑚分子生物学研究中[18]。Lopez[19]等早在1999年就应用AFLP方法研究了加勒比海Montastraea annularis的种间分类和遗传分化情况。可见，用于石珊瑚种群遗传多样性研究的分子方法是多种多样的，这有利于选择相对更好的分子方法用于其遗传多样性的研究，如构建基因文库等。

2.2 造礁石珊瑚的分子系统发生学研究

对于造礁石珊瑚这种形态受环境影响较大的物种且分类地位较为低等的生物，虽然国际上以其石灰质骨骼形态对造礁石珊瑚进行种类定义，但形态学分类在对于不同生态环境中物种的鉴别受到严重的限制。当对种的鉴定存在分歧时，用于构建进化树更显得说服力不足。用于构建石珊瑚分子系统发育树的基因主要是线粒体基因和核rRNA基因，通过核酸序列的比较分析得到的系统发育树，在对传统分类系统进行验证和补充的同时，也可为传统的形态学分类中存在的有争议的或形态学尚不能解决的某些类群系统发育学问题提供新方法[20]。

2.2.1 科以上阶元的分子系统发生 在珊瑚的传统分类系统中，一直是依据形态学特征进行分类。珊瑚类生物的系统分类学地位和进化史研究很多是不清楚的，尤其是在石珊瑚目中。石珊瑚目的系统分类目前存在许多问题，主要是由于其生活史、繁殖方式和物种的表型可塑性较强。运用稳定的分子生物学方法研究石珊瑚分类的时候发现：腔肠动物门的线粒体DNA进化速率极为缓慢并呈现较低的多样性[21]，并且对于运用石珊瑚核基因的分子标记进行系统发生研究，其研究结果均不理想（除了鹿角珊瑚科以外）。以分子生物学资料（基本上为核rRNA序列和线粒体DNA序列为主）探讨珊瑚系统分类和亲缘关系开始于1990年代初期，而到1995－1997年陆续有相关的文献发表。Chen等1995年应用了28S rDNA分子标记的方法研究了珊瑚虫纲的系统发生关系，作者认为石珊瑚是单独起源群[23-26]；28S rDNA序列 5’-n rDNA的序列（225 bp）初步的结论显示石珊瑚是属于单一起源群，其石灰质骨骼是石珊瑚单独起源的特征，同时该研究结果也支持某些类群现生种与化石种石珊瑚之间演化的一致性[22-25]。但是16S rDNA的部份序列分析却发现与传统石珊瑚演化树与化石资料不相吻合，其研究结论为石珊瑚石灰质骨骼是多重起源的特征[25]。石珊瑚长时间被认为是具有霰石骨骼的单起源群体，骨骼形态和分子数据的对比分析表明石珊瑚中亚目和科水平的系统发生关系不一致。因为分子数据表明石珊瑚的骨骼可能已经演化了四次。Chen[26]描述了石珊瑚28个种类中线粒体12S rRNA基因片段的分子演化式样，并且使用这基因片段去推断石珊瑚的演化历史，发现有两个不同的进化支系。Romano和Cairns[27]利用分子数据、形态数据和化石记录讨论了石珊瑚亚目和科之间系统发生关系的一致性和冲突，使用16S rRNA基因序列数据进行分析发现的有力证据表明石珊瑚分为两支并且推断分歧可能出现在300万年以前。运用线粒体DNA序列数据进行的系统发生分析不支持当前建立在骨骼形态和化石记录基础上的系统发生关系，然而支持石珊瑚目分为两支的假说。

2.2.2 造礁石珊瑚属阶元的分子系统分类 属阶元的分类是分类中十分重要的一个环节，在珊瑚分类中很多属间的分类混乱，进化关系不明确，由于传统形态学鉴定方法的局限性和化石标本的缺乏，目前对于属间进化关系的研究只能靠分子生物学的方法来辅助解决，这同时也有助于对形态学分类和化石标本推断进化关系结果的验证。

鹿角珊瑚科是石珊瑚中数量最多的一科，包括鹿角珊瑚属、蔷薇珊瑚属、假鹿角珊瑚属和星孔珊瑚属等4个属[3]。Fukami等研究了鹿角珊瑚科四个属的12种珊瑚，分析细胞色素b和ATP酶6的序列多样性，根据核苷酸代替的速率推导出鹿角珊瑚科四个属的进化关系。将鹿角珊瑚科分为三个主要的进化系群：星孔珊瑚属、蔷薇珊瑚属和鹿角珊瑚属。而假鹿角珊瑚属做为蔷薇珊瑚属的一支，说明假鹿角珊瑚是从蔷薇珊瑚中分化出来的。由于形态学和繁殖方式的不同，Fukami建议将Isopora和Arcopora两个亚属独立为两个属[28]。Odorico分析研究五种鹿角珊瑚核糖体的ITS序列和5.8S序列，发现鹿角珊瑚核糖体ITS序列是迄今为止珊瑚类中最短的。在鹿角珊瑚属中，某些鹿角珊瑚的ITS序列存在极大差异，比如强壮鹿角珊瑚的ITS1序列被发现具有高度多样性（29%）等，这些数据跟鹿角珊瑚科网状演化历史是一致的[29]。Oppen等研究了Isopora/Acropora ITS2 rRNA的次级结构发现鹿角珊瑚ITS2次级结构不同于一般真核生物。并且发现巴拿马地峡的出现将加勒比海和太平洋分开，使两边的Isopora和Acropora分别在加勒比海和太平洋继续进化，鹿角珊瑚在两边产生了不同的进化结果[33]。

蜂巢珊瑚科是造礁石珊瑚中第二大科，蜂巢珊瑚科包括十几个属。Huang等同时使用分子生物学和形态学数据共同分析该科13个属41个种的81个样品。其中运用分子生物学方法主要使用了两种线粒体的分子标记（COI和一个非编码序列），其研究结果表现为形态学数据和分子生物学分析结果存在明显的差异，这样就对传统的蜂巢珊瑚科内的分类方法进行了挑战[8]。

现在在很多研究过程中发现，运用分子生物学方法和传统形态分类学分类的结果存在矛盾，我们如何正确理解分子生物学的结果和处理分类关系时必须谨慎小心。分子标记的选择对于最终的结果起着重要作用，研究者对于不同的生物必须慎重选择适用的分子标记。

2.2.3 造礁石珊瑚种阶元的分子系统分类 种是生物学研究中最基本的和最重要的概念之一，但造礁石珊瑚在种水平鉴别相当困难。如果不能辨别种类，将不可能辨别出种的范围、界限、种群散布以及种间关系，也不能确定哪个种群濒临灭绝，甚至已经灭绝。珊瑚的种类很难定义，原因如下：a) 趋同进化：形态相近的种类可能是亲缘关系相近的近亲种类，也可能是亲缘关系较远的隐蔽种[30]，这是因为不同种珊瑚为适应相同的生境而表现出相同或相似的形态学性状。b) 表型灵活性：同种珊瑚可以适应不同生境，而在不同的环境条件下发育生长成不同形态。c) 杂交和网状进化：由于许多珊瑚几乎同时集中产卵，使得不同种类有机会杂交。Veron[3]提出了珊瑚的网状进化方式不同于经典的达尔文进化论。根据这个理论，珊瑚的物种是通过持续的杂交融合和基因漂变形成的。Veron对种的概念是模糊的，使种的边界变的不清楚，重新定义种的概念非常必要[31]。

种阶元的分类也存在很多争议，主要在于相似种间的鉴定和不同生存环境相同种的确定。由于造礁石珊瑚极易受生长环境塑造。不同生长环境生态种差别极大，同时相同生长环境中不同种的石珊瑚也可能生态型较为接近，难以靠传统的方法鉴别。此时分子生物学方法可作为工具辨认区分。Flot等对在冲绳，新喀里多尼亚岛和菲律宾采集的排孔珊瑚样品使用多种线粒体标记进行分析，他们发现在具有相同形态学特征的排孔珊瑚种群之间线粒体基因型存在多样性，也分析出地理分布与基因流之间的关系，并且证明排孔珊瑚属内种之间的形态学多样性与基因多样性是相关的[32]。Oppen等使用核DNA序列和线粒体DNA控制区域分析蔷薇珊瑚属，证明蔷薇珊瑚属内形态学构建的进化关系与线粒体DNA和核DNA作为分子标记的分子生物学构建的进化关系基本上不存在一致，而且线粒体DNA和核DNA为分子标记的分析结果也存在矛盾。可能的解释是部分蔷薇珊瑚种通过杂交发生了基因交换并构成了网状进化模式，或蔷薇珊瑚核基因和线粒体基因进化速率不同[33]。Morton等通过研究形态学特征和分析ITS1、5.8S及部分ITS2 rDNA序列，成功的解决了香港地区中华扁脑珊瑚和Platygyra. pini.由于形态学相似和生态位重叠造成分类混淆的问题，并计算出这两个种分化的时间[34]。Stefani对马尔代夫四种沙珊瑚进行形态学微细结构和分子生物学种边界的研究探讨，使用5.8S rRNA和ITS2 rDNA作为分子标记，分析出沙珊瑚属进化关系，显示沙珊瑚进化分为两支[35]。在加勒比海地区的石珊瑚研究中，很多科学家对Montastrea annulari种的界定一直持有不同的看法。这种珊瑚具有高度可塑的形态学特征。有学者认为Montastrea annulari实际上是三个相似种（M.annularis、M. faveolata和M. franksi）的集合[36]，它们的最终集合已经形成了150万年[37]。Knowlton证明Montastrea属三个相似种（M. annularis、M.faveolata和M. franksi）繁殖是分离的，这种分离主要是由于不同时间排卵及它们部分基因不同，因而他认为这三个种是不同种。相反，1997年Szmant报道Montastrea三个相似种（M. annularis、M.faveolata和M. franksi）存在杂交的浮浪幼虫，并且他成功繁殖了杂交幼虫，因而他认为这三个种是同种。Medina[38]等用ITS序列和线粒体基因COI序列进行分析Montastrea种并未发现三个种之间的差异，支持Montastrea annulari只是一个种的假设。2005年Hironobu Fukami Nancy和Knowlton[39]再次对Montastrea的这三种珊瑚进行线粒体DNA的全序列分析，得出这三个种存在差异，计算出它们之间分化的年代，并指出了M. annularis和M.faveolata从原始的祖先先分化出来，接下来又从M. annularis中分化出了M．franksi。到现在关于Montastrea种的争论还在继续着。虽然分子生物学方法可以确定某些进化关系，但是到种的确定时，常由于缺乏数据而没有确实的说服力，所以在研究珊瑚的进化和分类时必须结合形态学方法才能真正确定进化和种间关系。所以我们应该使用分子生物学和形态学结合方法对我们还不能完全确定种边界定义，也可以对有疑问的进化关系进行验证。

3 研究展望

随着分子生物学的不断发展，人们可以选用更多新的分子标记应用于物种系统演化和分类研究。在选用不同遗传分子标记对物种进行分类及系统进化研究过程中，时常得出一些与传统分类学结果不符，甚至完全相反的结果。但是，大量的比较研究表明，形态学进化和分子进化是各自独立的，遵循不同的进化规律，分子系统发育学的研究结果不可能完全代替由形态数据建立起来的系统发育关系，在某种程度上还只能是对传统系统学的验证和补充。所以在选用遗传标记时，应全面了解每一种分子标记的特点和适用范围，根据不同的分类目的选用不同的标记和几种标记联合使用，使所得结果更为合理。简而言之，分子生物学新技术的应用只是运用了以前不曾运用的方法去解决过去用传统方法不能解决或难以解决的问题，但是这些新性状和形态学性状一样也有其局限性，只有将分子系统学研究结果与传统的生物学研究结果相结合，才有可能对生物多样性和系统发生学做出更好的描述和解释。今后石珊瑚分子发育学研究将着重在以下几个方面：

3.1 建立较为可靠的系统发生关系

应用分子标记技术结合形态学数据资料重建石珊瑚、六放珊瑚亚纲和珊瑚虫纲的系统发生关系，比较分析出两者在构建系统树时的差异与联系，有效准确的建立石珊瑚、六放珊瑚亚纲和珊瑚虫纲的系统发生关系。

3.2 加强对石珊瑚起源与进化模式的了解

通过石珊瑚系统发育学的研究了解石珊瑚石灰质骨骼特征及繁殖方式，进一步了解石珊瑚部分基因序列与环境、石珊瑚石灰质骨骼特征之间的关系，为石珊瑚的退化后恢复及保护区保护的有效性提供帮助。

3.3 体现珊瑚礁的重要价值

海洋中有四分之一的生物生活在珊瑚礁中，珊瑚礁生态系统具有极丰富的生物资源，是渔业的繁殖基地，为人类提供重要的食物和药物资源；珊瑚礁的前身-古代的生物礁，蕴藏着极其丰富的油气资源和其他矿产资源，是人类的巨大财富；珊瑚和珊瑚礁在其生长和发育过程中记录下大量环境因素的数据，因而，它又是科学研究中长期环境变化的巨大信息资料库。对石珊瑚及六放珊瑚亚纲进行分类及系统发生关系的研究将是其它学科研究的前提与基础。

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Progress in taxonomy and genetic diversity of Scleratinia corals

YOU Feng, HUANG Hui, DONG Zhi-jun, ZHOU Guo-wei
(1. Key Lab of Marine Bioresourses Sustainable Utilization, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Science, Guangzhou 510301, China;2. National Experiment Station of Tropical Marine Biology, Sanya 572000, China;3. Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 10039, China)

This article summarizes the genetic diversity and taxonomy of Scleractinia. We put emphasis on the taxonomy and genetic diversity of Scleractinia order by molecular biology approaches. The method of using molecular biology approaches may be a effective way to distinguish species that can not be identified with traditional taxonomy while the use of DNA sequences for phylogenetic reconstruction may be the most useful and effective way for classifying Scleractinia corals. In the previous studies ribosomal RNA and mitochondria DNA have been widely used in characterizing the genetic diversity of Scleractinia corals. Finally it is significant to investigate the taxonomy and genetic diversity of Scleractinia corals of reef-building so as to make for protecting ecosystem of coral reefs and to provide theoretical basis of recovery.

mitochondria DNA; ribosomal RNA; scleratinia corals; taxonomy; genetic diversity

Q959.135.3; Q75

A

1001-6932(2010)04-0459-07

2009-07-20；

2009-11-11

国家海洋局908专项资助项目(908-ST-01-08-珊瑚礁调查), 国家自然科学基金项目(40776085), 广东省908专项项目(GD908-01-03)

尤丰（1984－），男，硕士研究生，主要从事珊瑚礁生态学研究。电子邮箱：mengqiuyu84427@163.com