赤潮毒素软骨藻酸检测方法研究进展

顾佳萍，袁涛

(上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240)

赤潮毒素软骨藻酸检测方法研究进展

顾佳萍，袁涛

(上海交通大学环境科学与工程学院，上海 200240)

海洋环境污染日趋严重，赤潮的频发导致赤潮藻毒素严重威胁着人类健康。软骨藻酸是由拟菱形藻产生的一种记忆丧失性贝类毒素，在很多海域均有检出和中毒报道。针对中国相关研究较为薄弱的现状，本文首先介绍软骨藻酸的研究背景、理化性质和毒性，然后对其检测分析方法进行了详细的综述，讨论了生物分析法、高效液相色谱法、酶联免疫分析法、毛细管电泳法等各自的优缺点及适用性，并建议今后要结合分子模拟技术、分子印迹技术、胶体金、生物传感器等技术研发更快速、简便、灵敏的新方法。

赤潮藻毒素；记忆丧失性贝毒；软骨藻酸；检测；进展

Abstract：Marine pollution becomes worse in recent years and frequently occurred red tides is threatening human health due to the marine algal toxins.Domoic Acid (DA),an amnesic shellfish toxin mainly produced by Pseudo-nitzschia,has been identified and reported with poisoning cases in many sea areas.As the relevant researches are limited in China,this paper firstly introduced the research background,physical-chemical properties and toxicity of DA.The analytical methods were then reviewed in detail.The pros and cons of the methods,such as bioassay,high-performance liquid chromatography,enzyme-linked immunoassay,capillary electrophoresis,were discussed.Finally,some promising directions were proposed to develop faster,simpler and more sensitive detection methods for DA based on several new developed technologies such as molecular simulation,molecular imprinting,colloidal gold,biosensor and so on.This paper provides some important information for the DA relevant researches.

Keywords：marine algal toxin; amnesic shellfish poisoning; domoic acid; detection; development

近三十年来，海洋环境污染日趋加重，海洋赤潮也频频发生。由赤潮生物产生的大量生物毒素通过食物链污染了水生动物，进而威胁人类健康。软骨藻酸（Domoic Acid,DA）是一种记忆丧失性贝类毒素，它最早是在 1987年加拿大爱德华王子岛的东海岸因食用紫贻贝而造成的食物中毒事件中被发现的。中毒者症状主要表现为腹痛、腹泻、呕吐，并伴有记忆丧失、意识混乱、不能辨认家人及亲朋好友等严重精神症状，严重者陷于昏睡状态甚至死亡，中毒者即使在病愈后仍然丧失记忆长达十几个月，因此称之为记忆丧失性贝类中毒。后来经过专家们分析鉴定，发现该中毒物质为 DA，主要由经常在加拿大东海岸形成赤潮的一种硅藻——多列拟菱形藻产生[1]。此后，在加拿大、美国海岸，拟菱形藻赤潮产生 DA而引起危害的事件不断被报道。

由于贝类毒素毒性大，反应快，无适宜解毒剂，给防治带来了许多困难，因此开展贝类毒素的快速检测研究对确保水产品安全及人体健康极为重要。目前国外对DA的研究主要集中于水产品中含量的检测方法以及毒性研究，但中国对其研究还属于起步阶段，尚缺乏有效的检测手段和监控网络。

中国是一个贝类生产大国，近几年来的赤潮藻类污染对贝类的影响越来越大，贝毒不仅对人类的健康构成威胁，而且影响了贝类的销售，造成经济损失。因此，建立快速、高效、特异、灵敏的贝毒素检测技术至关重要。虽然中国检出DA的报导还很罕见，但在中国海区，已经检测到了多种拟菱形藻，其广泛分布在中国沿海，其中有九种拟菱形藻是潜在产毒种，在非中国海区均有产毒报道[2]。中国现在几乎没有检出DA有可能是因为目前中国拟菱形藻污染还不严重，但也有可能是现有的检测方法还不够灵敏，缺乏有效的检测技术。本文综述了国内外相关研究进展，详细分析了各种检测方法的优缺点，并讨论了今后研究的新思路，为中国尽快建立高效的检测痕量DA的方法提供重要参考。

1 软骨藻酸理化性质和毒性

DA分子式为C15H21NO6，分子量为311.33，其分子结构如图 1。DA纯品为白色固体粉末，溶于水，微溶于甲醇，熔点223～224 ℃，在紫外光谱区最大吸收波长为242 nm，在体积比为1:9的乙腈/水溶液和-12 ℃黑暗条件下可保持稳定一年左右[3]。DA在常温或光照下在碱性溶液中不会降解[4]，但它在酸性溶液(pH =3)中一星期降解50%[5]。DA分子中含有三个羧基和一个仲氨基，羧基结构的pKa分别为 2.10、3.72、4.97，氨基结构的 pKa为 9.82[6]，因此它在溶液中的存在受pH的影响[7]。

图1 软骨藻酸分子结构Fig.1 Molecular structure of DA

DA是一种兴奋性脯氨酸衍生物和神经毒素，是浮游植物代谢的产物，可以在被藻类污染的海洋食物特别是贝类中检测到，其结构与红藻氨酸和谷氨酸相似，是红藻氨酸受体的兴奋剂[3,8]。DA主要由某些拟菱形藻属和菱形藻属的海洋硅藻产生，Walz等[9]检测了水中澳洲拟菱形藻的含量及DA的浓度，只要该种藻在水中的含量达 4.0×103个/L，就可检出DA。

水生动物(尤其是贝类)能富集DA，但同时它们具有很强的耐受力，而食用这些水生动物的鸟类、海洋哺乳类动物和人类则会引起不同程度的中毒症状。贝壳类动物的摄食过程是通过不断过滤水流进行的，这样在它们的内脏组织中会浓缩蓄积DA，并在组织间迁移，可通过食物链影响人类健康。DA可以通过胃肠粘膜吸收，但吸收率低[10]，其纯品也可通过呼吸道、角膜和皮肤直接进入体内而产生危害。在血液中，DA以带电的亲水分子形式存在，能够到达所有外周组织[11]。

DA可影响人和动物的消化道、心血管系统、中枢神经系统[12]，它对与内脏功能有关的脑干区域具有兴奋作用，而对与记忆有关的脑区域具有明显的神经毒性作用。此外，DA也会损害脊髓、视网膜[12,13]。研究发现，贝组织中DA含量达到40 mg/kg时可引起食用者中毒，150 mg/kg时有致死危险，人类通过进食可耐受的最大限量为20 mg/kg，加拿大首先制定了DA的安全限量标准为20 μg/g贝肉，欧洲、日本也相继将该种毒素列为贝类常规检测项

目[7,14,15]。

2 软骨藻酸检测分析方法

DA的检测方法有好几种，主要检测的是贝类、浮游植物、海水以及人体和动物血液、尿液、粪便中DA的含量。常用的检测方法主要有生物分析法、高效液相色谱法、酶联免疫分析法、毛细管电泳法等等。生物分析法灵敏度较低，选择性弱，因此应用有限。高效液相色谱法是目前官方指定的标准方法，该方法检测限低，灵敏度高，特异性强，应用广泛。高效液相色谱的检测器有紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，由于贝类提取液中干扰组分复杂，光度检测往往不能提供化合物的充分结构信息，因此会引起假阳性的结果，而质谱能提供化学物质的结构信息，是一种高效的方法，能作为 DA确证的分析方法。另外，在传统检测方法的基础上，近年来发展了许多新的检测方法，如神经受体结合检测技术、生物传感器法等，但目前应用范围不广，还存在一些缺陷，没有被广泛采用。

2.1 生物分析法

小鼠生物分析法是最早用于DA检测的一种经典方法，其原理是将毒素注射入小白鼠体内，根据注射后小鼠的存活时间和中毒症状来评价毒性，一般用半致死剂量表示[16]。1987年该方法首次应用于加拿大DA中毒事件中DA的测定，结果显示该方法适于检测贝类组织中高浓度的DA(高于30 μg/g)，DA浓度较低时无法检测(低于20 μg/g)[17]。该方法具有应用广泛、有历史数据、能表达出样品实际毒性、不需复杂设备等优点，但仍然存在着许多缺陷和不足，如灵敏度低、假阳性高、重现性差、操作时间长、无法区别毒素的种类等[17]，已逐渐被其他新的分析方法所取代。

2.2 高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法是目前检测DA应用最广的方法，已被多国列为国家标准方法，中国国家标准[18]中规定使用反相高效液相色谱法检测海产双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品(不包括盐渍制品)中的DA含量，该方法检测限为1 μg。

生物分析法注重的是样品毒性的分析，其专一性和灵敏度低，而高效液相色谱法则能灵敏、快速、准确地确定各种毒素成分，被广泛用于研究和确认实验。HPLC检测DA是利用其在242 nm处具有最大吸收值的特征使用紫外或二极管检测器进行检测，或者将 DA衍生后通过荧光检测器进行分析，或使用质谱进行检测。其中质谱法检测范围广、灵敏度高、定性准确、速度快、操作简单，已被越来越多的研究人员采用。

2.2.1 紫外检测法 高效液相色谱－紫外检测法（HPLC-UV）特别适用于贝类组织中DA含量的测定，尤其适用于毒素含量超过20 μg/g的情况。Lawrence等人建立[19]以及 Quilliam 等[20]改进的HPLC-UV法采用了反相C18柱在242 nm处检测DA，该方法已被英国、爱尔兰等国定为标准方法[21]。后来，又有一些研究人员对此方法进行了改进。López-Rivera等[22]建立了一种不需要固相萃取预处理检测DA的HPLC-UV法，通过等梯度淋洗以及控制流动相pH来分离化合物，结果表明，最佳pH为2.5，方法检测限为25 ng/mL。该方法快速、灵敏，能成功检测大批量贝类样品。HPLC-UV法已经被很多研究人员用来检测贝类等动物组织中的DA含量。Costa等[23]用HPLC-UV法检测了葡萄牙海岸的两种章鱼E.cirrhosa和 E.moschata体内DA的含量，结果表明，DA含量超过了100 μg/g，其中，E.moschata体内毒素含量更高，表明DA可能通过食物链由这种章鱼体内进入更高级消费者如人类体内，潜在危险性更大。中国对DA的检测大多采用HPLC-UV法，陈西平等[24]采用该方法检测了部分水及水生动物中DA的含量。结果表明，虽然在海水及地面淡水中未检出 DA，但部分海洋贝壳动物体内有检出。因此，随着海洋污染的加剧，现阶段中国的DA污染问题不容忽视，应加强对其污染状况的监测。

2.2.2 荧光检测法 高效液相色谱－荧光检测法是使用衍生剂将 DA 衍生成含荧光基团的物质，用荧光检测器进行检测，在DA分子上引入荧光基团可使方法的灵敏度提高。James等[25]使用NBD-F来衍生化 DA，用等梯度淋洗程序分离化合物，激发波长为470 nm，发射波长为530 nm，方法检测限高于1 ng/mL，贝类组织中DA的回收率＞95%，当用强阴离子交换SPE柱萃取DA时，检测限达到6 ngDA/g贝类组织。Chan等[26]参考了这种方法来检测DA，但他们改进了样品预处理方法，即在SPE柱中加入TiO2，可以更好地吸附DA，并探讨了最佳pH，结果表明，吸附的最佳pH为4，解吸时pH则为11，吸附平衡时间为2小时，最佳吸附剂装载量为0.67 mgTiO2/ngDA。最近，Maroulis等[27]采用NBD-Cl柱后衍生DA进行检测，成功测得了贝类组织中DA含量为75 μg/kg的样品，该方法检测限低至25 ppb，能实现全自动化分析，对样品预处理要求低，干扰少。由于大多数衍生试剂价格昂贵、不稳定，且其分解产物可能出现在色谱图中，同时衍生试剂的变质也可能导致毒素的不完全衍生化，因此荧光检测法的实际应用很少。

2.2.3 质谱法 现今，由于质谱技术具有检测范围广、灵敏度高、速度快、操作简单等优点，已经成为 DA检测的常用手段。高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术可以不使用衍生试剂和毒素标准品，相比其他检测器，具有很大的优势。然而本方法对设备条件要求较高，现阶段还不能大量用于基层的日常监测工作。Lawrence等[28]建立的高效液相色谱－电喷雾离子阱质谱法(HPLC/ESI-MS)法是一种高灵敏度、高选择性的方法，被应用到了环境中各种介质的检测中，并被后人不断改进，但是这种方法对样品预处理的要求较高。宋琍琍等[29]参考了这种方法来测定DA残留。样品经50%甲醇提取，LC-SAX柱净化，然后选用电喷雾离子源进行测定分析，该方法的定量限为 0.02 μg/g。Pardo等[30]采用加压湿法萃取(PLE)来提取DA，然后用液相色谱-电喷雾电离双质谱(HPLC-ESI-MS-MS)法来检测DA，电离源采用电喷雾可以提高分析信号，方法经过优化后回收率在81%至95%之间，他们用此方法成功检测了46个西班牙超市里的贝类样品，表明该方法能进行大批量检测。Wang等[31]采用LC-MS对水样和浮游植物中的DA进行了定性和定量分析，样品预处理采用C18柱进行固相萃取，结果表明，酸性条件有利于在C18柱上保留亲水性的DA，加标水样的回收率超过了 90%，浮游植物样品的回收率则接近98%，方法检测限为0.03 ng/mL，本方法不仅可以证明DA是由浮游植物产生的，还揭示了溶解在水中的DA也有可能进入海洋食物链网。Iglesia等[32]也采用LC-MS法检测了海水中的DA及它的异构体，但样品预处理采用的是固相萃取盘，该方法的检测限为 0.02 ng/mL，回收率为92.1%～110.6%，用此方法能检测海水中的痕量DA。

2.3 酶联免疫分析法(ELISA)

免疫分析法是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法[33]，即根据抗原-抗体反应，采用特异性贝类毒素的抗体来检测 DA。免疫分析法主要包括酶联免疫法、放射性免疫法、荧光免疫法等，具有方便、快速的特点，但缺点是费用较高，而且各毒素之间的交叉反应低，不能全面体现出样品的毒性。检测DA所采用的免疫分析方法主要是酶联免疫吸附法（ELISA）。

ELISA是利用抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果，是目前应用最广泛的免疫学检测技术，由于其实验结果可用目测，也可用酶标仪测定光密度值以反映抗原含量，所以有易定性定量的双重优点[33]。

Yu等[34]采用匙孔血蓝蛋白(KLH)和小牛血清蛋白(BSA)为载体，进行直接酶联免疫测定，结果表明，蓝贻贝样品的检测限＜25 ng/g，回收率为81.1%，Yu等还将实验结果用HPLC方法进行了验证，最终发现15种被污染的贝类样品中有10种样品的DA含量＜50 ng/g。

Maucher等[35]结合ELISA技术使用血液采集卡来提取小鼠血液中的 DA，这种方法可以避免 DA在血液中被清除。一般说来，在4小时内，99%的DA会从血液中被清除，但使用该方法后，DA在24小时内仍然能被检测到。该方法灵敏度高，用血液采集卡提取样品方便，因此可用此方法来监测海洋哺乳动物体内的DA含量。

Tsao等[36]采用单克隆抗体 ELISA检测法检测DA，并建立了基于单克隆抗体的胶体金免疫条检测法，免疫条检测法的检测限为5 ng/mL，在十分钟内就可完成检测。Tsao等的实验结果表明，用免疫条检测得到的结果与用 ELISA方法得到的结果有很好的吻合性，可以用来快速检测贝类样品中的DA。

另外，Shaw等[37]建立了基于基因工程单链抗体（scFv）竞争ELISA检测方法，相比传统方法，这种方法具有很多优势，基因工程单链抗体（scFv）可以在大肠杆菌中快速、大量地得到表达，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用于检测或其它用途。用该方法检测天然扇贝组织得到的数据与标准HPLC方法检测的结果基本相符。

大多数ELISA法采用的都是直接法，而许道艳等[38]则以 DA-OVA 为包被抗原，利用抗原抗体反应，建立了间接竞争酶联免疫吸附技术分析检测海水样品和海洋贝类中DA的方法。结果表明，该方法最低检出限为 10 μg/L，海水样品平均回收率为102.2%，贝类样品平均回收率为111.5%。

ELISA方法能够进行批量检测，但特异性较差，因而主要用于DA的初步筛选。另外，由于DA标准品昂贵，且DA分子量太小，因此制备免疫抗原较困难，从而限制了免疫方法在DA分析中的应用，目前国内还未见商品化的免疫检测试剂盒。

2.4 毛细管电泳法（CE）

毛细管电泳法的基本原理是不同荷质比的带电粒子在电场中具有不同的迁移速度而得到分离，然后再经过荧光或紫外检测器进行检测[17]。该方法具有操作简单、分离速度快、灵敏度高、运行成本低等优点，是贝类等生物体内DA含量常规检测较理想的方法。

Zhao等[39]建立了毛细管电泳-紫外检测法来检测海洋食物中的DA，首先用SPE提纯，使用了强阴离子交换柱和强阳离子交换柱，避免了基体中色氨酸的干扰，然后用CE-UV在242 nm处检测，该方法能用于检测贻贝、缢蛏、凤尾鱼等样品，最低能检出150 ng/g DA。但是在实验同时发现毛细管电泳法的灵敏度要比液相色谱法(检测限 20 ng/g)低。李大志等[40]也采用这种方法对2001年5月在大连海域(黑石礁海区)采集的 5种贝类进行分析，结果表明大连海域黑石礁海区的扇贝受到了DA的污染。Kvasnička等[41]则建立了一种在线毛细管等速电泳-毛细管区带电泳法来检测贝类和藻类中的DA。该方法优化了电解液系统，使DA能在25分钟内从甲醇提取液中分离出来，检测限为1.5 μg/L。

2.5 其他分析方法

除了高效液相色谱法、酶联免疫法等较常用的方法外，其他方法如薄层色谱法、神经受体结合检测法、生物传感器法等也被尝试用于检测DA。

薄层色谱法（TLC）是将固定相涂布在平板上，点样后用合适的流动相进行洗脱，不同组分的毒素将在平板上分开。该方法快速、简单，不需要使用复杂的仪器，对贝组织中 DA的检出限约为10 μg/g[42]。由于其检出限过高、无法准确定量，因此到目前未被广泛推广使用。

Van Dolah等人建立了竞争性神经受体分析测试DA毒素的方法，该方法非常灵敏，具有高度专一性[43]，目前已用来分析贝类和藻类的提取物[44]。其原理主要是使用青蛙的脑突触体作为受体，将红藻氨酸放射标记的 DA 结合在谷氨酸神经递质上，观察神经细胞流的情况。放射受体分析法测试毒素的检测灵敏度非常高，但由于实验中使用了放射同位素，限制了这一方法的推广使用。

生物传感器是一种快捷、低廉的检测技术，其原理是待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量处理的电信号，再经二次仪表放大并输出，便可知道待测物浓度。Stevens等[45]建立了一个表面等离子体共振生物传感器系统，可以检测贝类、藻类以及海水中4～60 ppb的DA。Lotierzo等[46]则采用了分子印迹聚合物作为传感器来检测 DA，该传感器与单克隆抗体相比，分子印迹聚合物芯片再生时，其识别性能不会受到影响且能够连续测量至少2个月。

3 结论与展望

目前国内外所采用的 DA 的检测方法都有进一步完善的必要，例如，对于免疫分析法，未来的发展方向是制作快速检测试剂盒，实现大批量样品的快速、简便分析。虽然现在已经制作出DA的免疫检测试剂盒，但还有着改进空间，如果能够结合分子印迹技术、胶体金、生物传感器等新方法，可以使DA的检测更简便、更快速、更准确。

高效液相色谱－质谱法是目前应用较广的方法，有极好的发展前景，但其对样品预处理要求较高，因此想要提高该方法的检测效果，应该从样品预处理方法上进行突破，提高进样溶液的纯度。一般样品预处理采用的是固相萃取法，除了改进固相萃取的各种条件外，寻找能更好吸附DA的固相萃取填充材料也极为重要。可以尝试采用分子模拟技术来筛选填充材料。例如，利用分子模拟技术，通过电脑软件计算分子间作用力来预测材料对DA分子的吸附效果，可以不通过实验就筛选出分子材料，这样不仅可以节省大量的时间、精力，而且有望取得一些创新性成果，是未来选取固相萃取材料极具潜力的一种手段。

全球海洋环境不断恶化，赤潮频繁爆发，海水中DA的污染水平很可能会随之加剧，但中国在这方面的研究还比较少，痕量DA的检测方法还不完善，尤其是针对海水中DA的检测研究非常少，因此迫切需要研究快速、简便、灵敏地检测海水中DA的方法，尽快掌握该类藻毒素的信息，及时采取有效手段防止危害发生，保障人类健康。

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A critical review for determination methods of the marine algal toxin-domoic acid

GU Jia-ping,YUAN Tao
(School of Environmental Science and Engineering,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China)

X55

A

1001-6932(2010)04-0472-06

2009-06-17；

2009-12-08

海洋赤潮灾害立体监测技术与应用国家海洋局重点实验室开放研究基金资助课题重点项目 (200801 )

顾佳萍 (1985－)，女，上海人，硕士研究生，环境科学专业，主要从事水环境新生污染物的研究。电子邮箱：feixuezhuangzhu@sina.com

袁涛，副教授，硕士生导师。电子邮箱：taoyuan@sjtu.edu.cn