PgP介导的多药耐药的逆转的研究进展

张正平,孙 勇,张正慧,孙启峰

(1.山东省莱芜市高庄医院,山东莱芜 271100;2.山东省莱芜市人民医院,山东莱芜 271100;3.山东省莱芜市牛泉医院,山东莱芜 271100)

肿瘤的化疗是其综合治疗的一个重要方面,而多药耐药(MDR)的影响是导致化疗失败的重要原因。国内外对逆转MDR也进行了很多研究工作,在各种引起MDR的机制中,以P糖蛋白(PgP)介导的 MDR占重要方面,针对逆转PgP介导的MDR的研究也较多,主要包括化学逆转剂、单克隆抗体和基因水平调控等方面,本文是对PgP介导的 MDR的逆转的研究进展做一个简要综述。

所谓MDR系指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时,对其他许多结构不同、作用机制不同的抗肿瘤药物亦产生交叉抗药性,它是一种独特的广谱耐药现象[1],PgP是一种ATP依赖性的跨膜外流泵,可将细胞内化疗药物排出细胞外,从而导致肿瘤细胞内化疗药物的蓄积浓度降低而不能有效杀死肿瘤细胞,从而导致肿瘤细胞耐药。几乎所有人类肿瘤细胞均有不同程度的PgP表达,但是对化疗不敏感或疗效差的肿瘤往往有较高的PgP表达水平[2],目前对PgP介导的MDR的逆转的研究主要从以下几个方面进行。

1 化学逆转剂

1.1 钙离子通道阻滞剂和钙调素抑制剂：钙离子通道阻滞剂是最早发现具有逆转MDR作用的药物,主要有Verapamil(VER)及其衍生物、双氢吡啶类化合物以及硫氮卓酮等。研究表明,钙离子通道阻滞剂在 mdrl基因的翻译水平上抑制Pgp的合成及活性,增加肿瘤细胞内的化疗药物浓度,克服肿瘤细胞的耐药性,提高化疗效果。但由于这些药物对心血管系统有 -定毒性,所以限制了它们在临床上的应用。Micktsch等报告在 VER的衍生物中 R-ver和 nor-VER具有钙离子通道阻滞作用很小,同时又具有较低的细胞毒性和较高的逆转能力的特性,故 R-ver和 nor-VER最有希望用于临床。具有MDR逆转作用的钙调素抑制剂主要包括三氟拉嗦、三氟丙嗦、氯丙嗦、氟奋乃静等吩噻嗪类化合物,其作用机制与钙离子通道阻滞剂相似。

1.2 免疫抑制剂环孢霉素 A(Cs A)及其类似物：无免疫抑制作用的 CsA衍生物 SDZ PSC833在体内外均能够逆转MDR 1基因的表达,阻止MDR克隆的形成,国外已将该药用于难治性白血病和实体瘤的临床研究[3,4];还有报道环孢霉素A及其衍生物 PSC 833可以明显改变抗肿瘤药物的药代动力学,使血药水平提高、减慢药物的体内代谢[5],而PSC833的逆转作用是环孢霉素 A的 5～10倍,且无环孢霉素A的免疫抑制作用和肾毒性,目前已进人临床试验。

1.3 抗激素类化合物：雌激素非完全拮抗剂三苯氧胺(Tamoxifen)作为 MDR逆转剂已用于临床。Kirk等在对 5种新的抗雌激素衍生物的逆转耐药效果的研究中发现,雌激素完全拮抗剂ICⅡ64的逆转效果更好,它使阿霉素和长春新碱对MDR细胞 MCF-7/adr的毒性分别增加 25,35倍。ICⅡ64能完全逆转转染了 mdrl基因的肺癌细胞 Sl/1.1对长春新碱的耐药,阻断 Pgp对长春新碱的泵出。抗孕酮化合物 RU486是孕酮化合物的衍生物。RU 486在低浓度((1μmol/L)时就可以有效抑制小鼠 Pgp的泵出功能,增加化疗药物蓄积,对人的 Pgp也有同样的效果。有人认为,RU486结构中的 1位(β-dimethylaminophenyl)取代基对于其拮抗剂Pgp功能发挥起到了重要作用,可见类固醇衍生物也是一类可以抑制Pgp泵出的逆转剂。

1.4 蛋白激酶抑制剂：蛋白激酶(PKC)可以改变药物在MDR细胞中的蓄积,在一些 MDR的肿瘤细胞 P KC的活性增加,推测抑制 P KC的活性可以对抗 MDR的发生。CGP41251是高度选择性的PKC抑制剂,具有抗肿瘤作用及有效的耐药逆转作用,它可使 3种 MDR细胞系对阿霉素和长春新碱的敏感性增加。Pgp是一个 ATP依赖的“药泵”,CGP41251可能是直接与 Pgp竞争 ATP或通过竞争 Pgp上的药物结合位点,从而阻断了Pgp的泵出功能,达到逆转耐药的作用.目前,对 CGP41251逆转机制尚不清楚,需进一步研究。KT-5720是另 -具有逆转MDR的蛋白激酶抑制剂,在非毒性的浓度下可有效增加耐药细胞 KB-V1、HU-1对化疗药物的敏感性,其抗耐药机制尚不清楚。

1.5 表面活性剂：表面活性剂如吐温 80,gremophorEL以及solutol HS15等被证明可以逆转 MDR,CRL1337是一种ethoxylated oleicacid制剂,它比 solutol和 gremophor表现出更高的耐药逆转活性。

1.6 多芳基取代咪唑类化合物：阮继武等人用设计并合成了几个新的多芳基取代咪唑类化合物(I一V),并选择了两种肿瘤耐药细胞株KBV和 M CF-7/adr,采用MTT法测定了其对由 P-gP介导的MDR的逆转效果.结果表明,化合物II和III具有很好的体外逆转 M DR活性(已申请专利保护[6]。

1.7 其他：除上面几种主要的逆转剂以外,5-溴甲苯[7],FK 506以及其结构类似物Rapamycin,新的哇琳化合物MS-209,精胺聚合物 Poly-SPM.(polymeric conjugate of spermine),十字花科蔬菜中富含的代谢产物Indole-Carbinol(13 C),还有一些化合物也具有MDR的逆转作用。

2 单克隆抗体

单克隆抗体是采用耐药细胞或耐药细胞膜蛋白作为抗原而制备的,可特异性识别、结合Pgp的胞膜外部分,从而逆转 MDR 1表型。将药物与单抗相连,借助抗原-抗体的生物特异识别机制,可实现药物的主动靶向。脂质体表面交联单克隆抗体制成的免疫脂质体可满足多种实际需要.抗 PgP的单抗能够抑制MDR细胞对PgP底物的外排,增加PgP运输药物的细胞毒性。实验证明,CD19的单克隆抗体可以抑止CD19和 PgP的相互作用,可导致淋巴瘤的 MDR逆转[8]。单克隆抗体FC-2.15能够识别肿瘤细胞膜表面的糖类抗原表面决定簇,并能够连接白细胞表面糖蛋白,然后通过补体介导的细胞毒性作用溶解细胞。FC-2.15可在补体的作用下明显提高人类乳腺癌细胞对阿霉素和紫杉醇的敏感性[9]。应用 PgP的单克隆抗体MRK-16可以封闭 PgP的离子通道,从而阻止细胞化疗药物的外流,充分发挥化疗药物细胞毒性作用。在小细胞肺癌的动物模型实验中,应用 MRK-16单克隆抗体可以抑制SCID大鼠细胞的耐药性和远处转移,同时提高大鼠的生存率[10]。这可能因为抗体不仅可以直接针对原位肿瘤细胞的PgP产生抗性,而且可以进入血液循环对转移的肿瘤细胞发挥细胞毒性作用。

3 基因水平调控

近年来,国内外开始将反义技术应用于肿瘤耐药性逆转的研究。根据碱基互补原理,设计出能特异地同相应靶基因结合的RNA或DNA,影响靶基因的转录和翻译,以达到特异抑制靶基因表达的基因调控技术,包括反义 RNA(AntisenseRNA)技术,反义 DNA(Antisense DNA)技术,又称反义寡核苷酸(Antisense oligodoxynucleotide,ASODN)技术、核酶(Ribozyme)技术。

3.1 MDR1基因的反义寡核苷酸(ODN)：MDR 1基因为一个较小的基因家族,虽然其转录调节过程尚不十分清楚,但已有研究证实其转录调节部位在MDRl基因 5'端上游非编码区内,设计这段反义基因,发现能使耐药的肿瘤细胞得到逆转。李惠芳等利用互补于MDR 1基因5'末端转录起始部位的ODN直接转染表达MDR 1基因的耐药细胞株KB-8-5后,细胞内 Pgp表达水平下降,为弱阳性,细胞内柔红霉素(DNR)浓度提高,被转染细胞对药物的LC50由原来药物敏感株的 5.6倍降为 3.2倍。以上结果说明 ODN逆转了PgP介导的药物耐受性,但逆转作用不完全.作者分析其原因之一为ODN的降解问题.为此,作者以脂质体 Lipofectin作为转基因载体,使 ODN的耐药逆转作用有所提高,被转染细胞对DNR的 LC50由原来药物敏感株的 5.6倍降为 2.5倍,提示脂质体可作为引导 ODN靶向治疗的方式之一,另有作者则认为对核酸上的氧原子进行硫代化、甲基化或用脂质体进行包裹等方法在提高细胞摄入ODN的同时,一方面增加了细胞毒性,同时也降低了核酸反义抑制的效应.将低相对分子质量的聚乙二醇(PEG)连接在 ODN的 5'的末端,结果显示,细胞内 ODN摄入率明显增加,高于其他修饰方法,且不影响细胞的生长特性,说明 ODN的 5'末端连接PEG在反义治疗领域具有广阔的应用前景。

3.2 MDR1基因的反义 RNA：ODN的作用是封闭 MDR 1基因而影响基因的转录,反义RNA则是与MDR 1基因的 mRNA形成二聚体而抑制 mRNA的翻译。曹江等利用高表达反义MDR1-RNA重组质粒 pRMAS转染耐药细胞 K562/Dox后,其 P-糖蛋白近乎阴性,细胞内柔红霉素浓度与敏感细胞系K 562几乎一致,说明 P-糖蛋白介导的药物外排几乎完全被抑制,显示将反义 RNA的模板DNA导入细胞内,可产生大量反义RNA抑制 MDR1基因表达。资料还显示,细胞除对阿霉素的耐受性完全被逆转外,对长春新碱(VCR)和柔红霉素(DNR)的耐受性仍保留 9.0倍和 14.1倍以上,说明 PgP表达转阴后,MDR并不能完全逆转,提示还有其他机制作用于细胞的MDR。最近,Nieth等报道应用反义RNA技术抑制胰腺癌细胞株 EPP85-181RDB和肠癌细胞株EPG 85-257RDB中MDR1基因的 91%的表达,两种细胞对化疗药物柔红霉素的耐药性分别降低到 89%和58%,该研究表明特异性阻断针对PgP依赖的 MDR基因表达可以逆转肿瘤细胞的多药耐药性[11]。

3.3 切割MDR 1mRNA的核酶：核酶(Ribazyme)是正常存在于细胞内并调控基因表达的RNA,是一类具有 RNA限制性内切酶活性的小分子RNA,它特异地与靶 RNA的特定位点结合,识别 RNA序列的 GUN X为 A,C,G)序列并进行切割阻断目的基因表达,其模型特征具有锤头结构(Hammerhead)、发夹状,其结构相对简单,可以降解 m RNA,因此也称为“分子剪刀”。Kobayashi等[12]合成两个核酶基因,分别切割MDRImRNA 196位和 179位密码子,将切割 MDRl m RNA 196位密码子的核酶构建于pHβAPrlneo载体上,电穿孔法导入到耐药的人急性淋巴母细胞白血病细胞系 MOLT3/TMQ800中,转染核酶后 MOLT3/TMQ 800对 VCR的耐药性由原来的 700倍(与其母细胞 MOLT3比较)下降至 20～30倍。在耐药的胰腺癌细胞系应用核酶逆转 MDR,耐药性更是由原来的 1600倍下降至 5.3倍。

目前通过细胞内注射法、电穿孔法、氯化钙、脂质体介导法进行外源性导入,但在导入细胞过程中极易被核酶降解。用化学方法对核酶加以修饰,可以提高其抵抗核酸酶的能力,但其生物活性明显减弱。通过逆转录病毒的内源性导入,有病毒滴度低、只能逆转分裂期细胞、细胞内表达率低和潜在致癌性等缺点。Lieber等应用腺病毒载体将核酶基因转入小鼠体内,证实了核酶基因在完整器官内可以有效表达并发挥其切割活性。

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