黄连木叶片基因组DNA提取方法

程世平,施 江,史国安,李亚杰,宋程威,尹小芳

(河南科技大学洛阳市牡丹生物学重点实验室,河南洛阳 471003)

0 前言

黄连木(Pistacia chinensis Bunge)属漆树科黄连木属,落叶乔木,雌雄异株,分布广泛,可作观赏树种,更是优良的油料及用材林树种。黄连木种子所含的油可作工业原料或用作食用油,是生产生物柴油的理想木本油料[1-2],黄连木还可药用[3]。目前对黄连木的研究主要集中在组织培养[4]、种子发芽试验和病虫害防治[5]等方面,有关黄连木分子生物学相关的研究还未见报道。

高质量的DNA是分子生物学关键的一步,是进行分子标记、基因组文库构建、亲缘关系分析等分子生物学研究的基础。植物DNA提取的方法多种多样,CTAB法经改良后被广泛应用,针对不同植物材料的特点,对CTAB法所做的改良各不相同,本文针对黄连木这种富含酚类、色素等极易影响DNA提取的物质,进行了相对应的改良,得出了一种简单、有效的提取黄连木 DNA的方法,为黄连木分子生物学方面的研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为黄连木嫩叶,叶片采下后立即装入自封袋,放入装有冰袋的采样盒中带回实验室,用蒸馏水冲洗干净、用滤纸吸干表面水分,置于-80℃冰箱备用。

1.2 方法

(1)常规CTAB提取方法按文献[6]的方法。

(2)改良CTAB法的操作步骤。参照文献[7-10]的方法并作适当改良,进行黄连木叶片DNA提取。①将CTAB提取液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,1.4 mmol/L NaCl,50 mmol/L EDTA),加入3% CTAB后,放入65℃水浴锅进行水浴。②待CTAB完全溶解后,每个10m L离心管中分装3 mL CTAB提取缓冲液,继续放入 65℃水浴。③取 3 g左右叶片,于液氮冷冻条件下迅速研磨成粉末,立即转入装有提取缓冲液的离心管中。④每个离心管中加入 120μLβ-巯基乙醇,20%的PVP溶液 520μL,5μL RNA酶(5mg/mL),迅速混匀。⑤65℃水浴1 h,期间每隔5min振荡1次。⑥放至室温后,加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1),抽提 2次。⑦上清液转入另一干净离心管中,加入 2倍体积预冷的无水乙醇,上下轻轻颠倒。⑧待出现大量沉淀时,挑出絮状DNA沉淀,将沉淀转入1.5mL离心管。⑨用体积分数70%乙醇洗涤1次。○10将离心管口打开,在无菌操作台内吹58 min。○11加入1m L 1×TE溶液,待DNA完全溶解后分装,-20℃保存备用。

(3)DNA纯度及浓度检测。将 DNA样品按照一定倍数稀释后,用紫外分光光度计测定OD260和OD280值,按照1个OD260值相当于50 ng/μL和稀释倍数来计算DNA的浓度,用 OD260和OD280的比值表示DNA的浓度,最后将DNA样品稀释,进行琼脂糖凝胶电泳,用核酸染料(GeneFinder)染色,凝胶成像系统观察和拍照,检测DNA的纯度及完整性。

(4)RAPD检测。以所提DNA为模板,用RAPD随机引物进行PCR扩增,反应在Biometra PCR仪上进行。反应程序参考Surya Prakash等[11]的方法并作适当改动,引物购自上海Sangon。扩增产物用核酸染料染色,凝胶成像系统观察和拍照。

2 结果与分析

2.1 常规CTAB法提取黄连木叶片基因组DNA

采用常规CTAB提取方法,上清液在提取DNA的同时,富含大量的蛋白质、RNA、单宁、色素等物质,经沉淀出现的絮状DNA呈深绿色或黑褐色,溶解后的DNA较粘稠。琼脂糖凝胶电泳检测,DNA点样量5μL才出现微弱条带,且电泳孔道出现大量的蛋白质和RNA等(如图1所示)。经紫外分光光度计检测表明,其紫外吸收比值在 1.53左右。

2.2 改良CTAB法提取黄连木叶片基因组DNA

改良后的CTAB法尽量缩短了研磨样品与空气接触的时间;提取过程中充分振荡增加了提取液和研磨样品快速、充分的接触,有效去除了蛋白、色素等杂质。加入无水乙醇待 DNA析出时,立刻将沉淀挑出,防止多酚、单宁、多糖等物质与 DNA沉淀在一起,另外不采用离心方法沉淀DNA,有效避免了杂质和DNA混合在一起。

电泳点样量仅1μL,从电泳图(如图2所示)可知,改良法提取的DNA无蛋白、RNA等污染,条带清晰,亮度均一,纯度、完整性较高。经紫外分光光度计检测,其吸收比值 1.8左右。

2.3 RAPD扩增检测黄连木叶片基因组DNA的提取效果

运用常规CTAB方法提取的黄连木基因组DNA,经RAPD随机引物扩增后,琼脂糖凝胶电泳检测,条带模糊且片状拖带或涂抹带现象明显,扩增主带不明显。

采用改良法提取的DNA,进行RAPD基因扩增,扩增所用DNA随机选择,1和2,3和4,5和6,7和8,9和 10,11和12所用引物相同,RAPD扩增结果表明(如图3所示),同一引物之间扩增产物清晰、丰富。同一条引物之间扩增的条带有少许差异,是因为雌雄模板之间的差异所致。结果表明:改良法提取的DNA能较好的用于PCR扩增研究。

3 讨论与结论

高质量的DNA样品是进行相关分子生物学研究的基础,根据不同植物材料的特点,提取基因组DNA的方法也不尽相同。CTAB提取法在植物DNA提取过程中应用最广泛,提取效果较理想。黄连木叶片富含单宁、多酚、色素等物质,给DNA提取带来很大困难。本试验在常规 CTAB提取方法的基础上,针对黄连木叶片的特点,进一步对提取方法进行完善,设法减少酚类物质、色素、多糖等物质的干扰。

图3 改良CTAB法提取黄连木DNA的RAPD扩增效果图

为了尽量减少材料的褐化,并显著提高提取效果,首先将提取液分装并水浴保持在65℃,研磨后将研磨样品立即加入提取液;另外使用β-巯基乙醇和PVP的组合也有效避免了DNA在抽提过程中的褐变。因为 PVP是一种高分子合成树脂,能络合多酚物质,防止酚类化合物氧化成醌类,避免了溶液褐化具有抗氧化作用[12],β-巯基乙醇的巯基能与酚类物质竞争氧,有效避免了酚类物质氧化成醌,避免材料的褐变[13]。

为了简化提取过程,在加入研磨样的同时加入RNA酶,并进行短暂振荡可有效除去 RNA;为了防止多酚、单宁、多糖等次生代谢物质与 DNA一起沉淀[14],在加入预冷无水乙醇,轻轻上下混匀后,待大量絮状沉淀产生时,立即挑出DNA絮状沉淀,一定不能离心。否则,杂质都和DNA混在一起。

经改良的DNA提取方法,提取的DNA质量较好,并且简化了提取步骤。提取的DNA能直接用于PCR扩增等相关的分子生物学研究。

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