口蹄疫疫苗的研究历程

刘亚彬,闵成军

(江苏雨润食品产业集团有限公司,江苏南京 210041)

口蹄疫疫苗的研究历程

刘亚彬,闵成军*

(江苏雨润食品产业集团有限公司,江苏南京 210041)

口蹄疫(FMD)是世界性重大动物疫病,接种疫苗是特异性预防口蹄疫的有效手段,安全有效的疫苗是成功预防、控制乃至最终消灭口蹄疫的先决条件,在口蹄疫的防控中,灭活疫苗功不可没,但同时也存在许多隐患。随着分子生物学、遗传学及免疫学等学科的迅猛发展,口蹄疫疫苗的研究也取得了较快的进展,各种基因工程疫苗如亚单位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、可饲疫苗、多表位疫苗等不断涌现,为口蹄疫的防控带来了新的希望。

口蹄疫;疫苗;防控

口蹄疫(Food-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)所引起的偶蹄家畜的急性、热性、高度接触性传染病,羊、猪和牛都可患此病,有时还可以传染给人,其特征是在口腔黏膜和鼻、蹄、乳头等部位皮肤形成水泡和烂斑。本病传播迅速,危害性强,被世界动物卫生组织(OIE)列为国际动物贸易间必须检疫的A类动物传染病,我国农业部也将其划定为一类动物传染病,本病也是最具政治经济色彩的烈性动物疫病。因此,各国都在致力于控制和消灭口蹄疫的工作,而对大多数国家来说,疫苗免疫是防控本病的关键措施。近一个世纪以来,许多国家为了预防和控制口蹄疫的发生和流行,对疫苗的研究一直没有间断过。

1 由动物病损组织制成的疫苗

强毒接种、强毒与免疫血清混合接种易感动物,或采集病变组织,用A l(OH)3吸附、甲醛灭活病毒的方法制成的疫苗。这类疫苗在20世纪20年代见于欧洲。由于制造成本高,在生产中易散播病毒,疫苗中残存的活病毒难以用甲醛灭活,且免疫力有限,因而未能广泛推广应用。

2 实验动物疫苗

将口蹄疫病毒适应于实验动物后,取含毒量高的动物组织制备灭活疫苗;或经实验动物连续传代,培育成弱毒后制造疫苗。这种方法既可扩大病毒的产量,又可降低本动物增殖病毒造成的散毒;鼠苗兔苗、鸡胚苗都属此类。这类疫苗起始于20世纪40年代,在40年代～50年代的大规模预防接种中,不论在免疫效力还是经济方面都具有优势。但是,这类疫苗仍具有许多缺陷,弱毒疫苗存在遗传性不确定,而且病毒对一种动物的减毒并不能保证对其他动物减毒,长期使用可能会形成持续感染,长时间培育的弱毒不适宜新疫区的动物免疫。从20世纪70年代起,这类疫苗的研究和使用逐渐萎缩。

3 组织、细胞培养疫苗

20世纪20年代～30年代,口蹄疫病毒的组织培养研究盛行一时,但是一直到抗生素有效控制细菌污染之后才有了突破。1947年Frenkel H S[1]首次用牛舌皮碎块培养病毒获得成功。不久,法国和阿根廷用Frenkel的方法生产甲醛灭活疫苗,随后荷兰等一些欧洲国家把Frenkel疫苗列为牛的计划免疫用苗,改变了当时欧洲口蹄疫的流行态势,疫情明显下降。此苗虽能较好保持抗原性,且免疫后不出现变态反应,但还是不适宜大规模生产。

真正使用大规模工业生产的细胞是1962年英国Pirbright动物病毒研究所的M owat G N等[2]培育的BHK细胞系,生产口蹄疫灭活疫苗,并很快商业化。此外,IBRS-2和仓鼠胚胎传代细胞(NIL-2,也叫IFFA 3)也用于生产病毒。

在灭活剂方面,最早采用甲醛溶液灭活口蹄疫病毒抗原氢氧化铝胶混合物,但由于该混合物对细胞有毒性,且据报道,在欧美暴发的一些口蹄疫与灭活疫苗中残留活病毒密切相关。后来采用作用于核酸的AEI作为灭活剂,疫苗抗原性保持较好,但毒性仍较大。后又用的BEI(binary ethylenim ine)作为灭活剂,这种灭活剂毒性小,易于控制。

4 基因工程疫苗

1975年Bachrach等从口蹄疫病毒分离衣壳蛋白VP1,配以不完全弗氏佐剂,制成了一种蛋白亚单位疫苗,有良好的免疫效果,为研制基因工程疫苗提供了依据。20世纪80年代以来,国外许多实验室将DNA重组技术和口蹄疫病毒分子生物学的研究成果相结合,开展了基因工程疫苗的研究。1981年K leid D G等[3]成功地进行了口蹄疫病毒基因在原核细胞中的表达,用其免疫牛和猪,能产生中和抗体。1985年Mckercher P D等[4]用大肠埃希氏菌表达的A 12病毒的VP1融合蛋白,制成油佐剂疫苗。1995年Mchenna等通过基因工程技术构建了一株缺失RGD的口蹄疫病毒,并用此病毒接种牛使之产生抵抗强毒株攻击的免疫力。2000年赵凯等报道应用基因工程技术,将在大肠埃希菌细胞中表达的融合蛋白注射豚鼠和猪后产生保护作用。

以后许多研究者用原核或真核的多种表达系统(包括植物)表达口蹄疫的单一或多种结构蛋白,制成疫苗后免疫动物,免疫效果各不相同,总的不及完整蛋白的灭活疫苗。

5 化学合成肽疫苗

口蹄疫病毒VPI被确认为是主要免疫抗原蛋白,它带有重要的中和位点,根据VPI的基因序列,按推导的氨基酸序列化学合成VPI多肤,与能激发T细胞免疫的蛋白相连制成疫苗。Bitlle JL[5]首次根据O1型口蹄疫病毒、VP1基因氨基酸序列化学合成了20个氨基酸(140-160即B细胞抗原表位)的肽段,并与载体蛋白相藕联,接种豚鼠产生中和抗体并具有保护作用。1986年 Dimarchi R等[6]用VP1的2个免疫原区(141-158和200-210)的合成肽疫苗接种牛,大剂量(5 mg)免疫接种1次或小剂量(0.2mg)免疫接种2次,5/6获得保护。另外免疫球蛋白是体液免疫反应的主要成分,Chart EW等将O1K型FMDV的VP1(141-160位和200-213位氨基酸残基)插入到猪IgG分子的一条重链恒定区scIgG)内,构建了一新型嵌合体蛋白(F1-sc IgG),接种猪可产生特异性的中和抗体并诱导淋巴细胞的增生,免疫乳鼠可耐受1 000 LD50的FMDV攻击。这种嵌合蛋白的构建将为研制FMD的新型疫苗提供新的思路。随后的合成肽疫苗研制,大多通过增加T细胞和B细胞位点个数及其相邻两端的氨基酸位数来提高其免疫原性。在合成肽疫苗方面还有许多研究,但因这样或那样的问题,一直没有形成像灭活疫苗一样廉价有效的产品。

6 核酸疫苗

化学合成肽疫苗都是用病毒蛋白或致弱病毒制成,而核酸疫苗(DNA疫苗)是用携带免疫原基因的核酸制成。早在20世纪70年代末,人们就证实了动物体细胞具有摄取裸露DNA分子的能力。Ward G等构建了在巨细胞病毒(CMV)早期启动子调控下,携带有 A 12 FMDV VP1的DNA疫苗。H uang H等利用猪IgG序列融合蛋白基因构建的DNA疫苗,在不同的早晚期启动子控制下,接种豚鼠均可诱导中和抗体产生和脾细胞的增生,但未见到保护作用。后来,Beard C等采用同样的方法构建了分别携带有完整的、突变的蛋白酶3C和突变的病毒与细胞结合位点的3个DNA质粒,免疫猪后均可呈现出较强的抗病毒反应,但缺乏细胞结合位点的质粒DNA无论是肌肉注射、鼻内接种还是基因枪途径接种,被免疫猪仅有部分保护。Wong H T等[7]利用VP1上第141位～160位和第200位213位氨基酸插入到鼠、猪的免疫球蛋白基因制备了DNA疫苗。实验证明后者效果较好,接种小鼠不仅引起强烈的T淋巴细胞反应和很高的中和抗体水平,并可保护免疫猪抵抗10 FMDV的攻击并得到百分之百的保护。以后,Li G J等人工合成60氨基酸的肽段即 141～160(20AA)-21-40(20AA)-141-160(AA),并将其插入猪IgG分子重链恒定区的3′端构建DNA疫苗,肌肉注射豚鼠产生免疫反应,66%的免疫猪不受攻毒感染。考虑到核酸疫苗的免疫效果,Cedillo Barron L等同时将P1-2A基因、3C基因和3D基因同时插入到真核细胞表达载体pcDNA 3.1中,用该DNA疫苗接种猪,尽管可形成FMDV空衣壳粒子、3D上CD8+T细胞抗原位点的存在以及FMDV特异性抗体产生,但免疫效果不令人满意。

7 可饲疫苗

可饲疫苗是利用转基因技术将抗原基因导入植株中,获得表达抗原蛋白的植株,将该植株饲喂给动物后,可刺激动物胃肠道黏膜产生局部免疫应答进而获得全身性的免疫保护。Curtiss首次提出用植物生产可饲疫苗的概念,并进行了初步试验。1998年Carrillo等用表达了FMDV VP1基因的转基因拟南芥叶浸提取物腹腔注射免疫小鼠,诱导特异性抗体产生,该抗体能与VP1蛋白的第135位～160位氨基酸残基的多肽和完整的FMDV颗粒反应,所有免疫的小鼠均能抵抗FMDV强毒的攻击。2001年Carrillo C等[8]在马铃薯中成功表达了VP1蛋白,动物试验证明免疫动物也能抵抗强毒的攻击。He等构建的表达载体pBIl2lCTBVP1经农杆菌转化土豆,VP1和霍乱毒素B(CTB)的融合蛋白能在土豆中稳定表达,且具有一定的免疫原性。潘丽等已在番茄中成功表达了口蹄疫结构蛋白P1-2A,3C和VP1,其叶片提取物接种豚鼠以后能抵抗活毒的攻击。除此之外,研究者还在玉米、烟草、豇豆等植物中表达FMDV的抗原保护性基因,均已初见成效。可饲疫苗使用方便、安全、为牛羊等草食动物的口蹄疫防控带来光明的前景。

虽然传统的细胞培养来源的灭活苗很有效,但当口蹄疫(FMD)在无病国家爆发时,使用该疫苗仍然存在许多问题。这主要包括很难区分灭活苗免疫动物和感染动物、在无FMD国家爆发该病时不能产生迅速的保护、接种这种疫苗不能阻断形成病毒携带状态、疫苗生产需要严格的病毒防范设施等。虽然这种严格的防范设施有着很好的安全记录,但2007年8月在英国Pirbright具有高防范设施的实验室附近的农场暴发了FMD,引起此次暴发的毒株来源于该区的疫苗制造厂和动物卫生研究所。这次FMD的暴发促使人们进一步考察疫苗制造过程的安全性问题。而在美国联邦法只允许在梅岛的实验室从事感染性口蹄疫病毒(FMDV)的实验研究,而且,美国没有FMD的疫苗生产厂,主要是担心病毒的逃逸。由于灭活疫苗存在诸多问题,人们研制更加安全高效的FMD疫苗的步伐从未停止过。

[1] FrenkelH S.Research in foot-and-mouth diseaseⅡ:Thecultivation of the virus on a practical scale in explantation bovine tongue epithelium[J].Am JVet Res,1951,17:224-228.

[2] Mow at G N,Chapman W G.Growth of foot-and-mouth disease virus in a fib roblastic cell line derived from hamster kidneys[J].Nature,1962,194:253-259

[3] K leid D G,Yansura D,Small B,et al.Cloned viral protein vaccine for foot-and-mouth disease;responses in cattle and sw ine[J].Science,1981,214:1125-1131.

[4] M cKercher P D,Moore D M,M organ D O,et al.Dose-response evaluation of a genetically engineered foot-and-mouth disease virus poly peptide immunogen in cattle[J].AM J Vet Res,1985,46:587.

[5] Bittle JL,H oughten R A,A lexander H,et al.Protection against foot-and-mouth disease by immunization w ith a chem-i cally synthesized peptide predicted from the viral nudeotide sequence[J].Natu re,1982,298(5869):30-33.

[6] Dim archi R,Brooke G,Gale C,et al.Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide[J].Sc-i ence,1986,232:639-642.

[7] W ong H T,Cheng SC,Quirt E W,et al.Plasm ids encoding foot-and-mouth disease virus VP1 epitopes elicited immune response in m ice and sw ine and protected sw ine against viral infection[J].V irology,2000,(781):27-35.

[8] Carrillo C,Wigdorovitz A,T rono K,et al.Induction of a v-i rus-specific antibody response to foot-and-mouth disease virus using the structural protein VP1 exp ressed in transgenic potato plants[J].Viral Immunal,2001,14(1):49-57.

Progress of Foot-and-M outh Disease Vaccines

LIU Ya-bin,MIN Cheng-jun

(Yurun Group,N anjing,Jiangsu,210041,China)

Foot-and-mouth disease(FMD)is one of the most serious animal diseases,and vaccination is an effectivem ethod to guard against it.Safe and effective vaccine is the prerequisiteof successful prevention,controland eradication.Great contributions have beenmade by the inactivated vaccines but also there are m any hidden dangers.W ith the development of biotechnology,genetics and imm unology,rapid p rogress has also been made on foot-and-m outh disease vaccine research.Study and exploration on the subunit vaccines,synthetic peptide vaccines,DNA vaccines,transgenic p lant vaccines,m ult-iepitopes vaccines have been engaged in allover theworld.New hopes are brought by genic engineered vaccines.

Foot-and-mouth disease;vaccine;prevention and control

S852.659.6

A

1007-5038(2010)04-0272-03

2010-04-06

刘亚彬(1981-),男,安徽界首人,硕士,兽医师,主要从事养殖管理工作。*通讯作者