西瓜多倍体研究应用进展

王友平，朱金英，徐光东，王磊，张洪勇

（德州市农业科学研究院，山东德州，253015）

西瓜多倍体研究最早始于日本，自1937年勃莱克斯利（Blakslee）和艾弗瑞（Averry）发现秋水仙素诱导染色体加倍效果以后，掀起了用秋水仙素诱变多倍体育种的热潮。日本木原均和山下孝介于1939年发表关于获得四倍体西瓜的报告，由此进入了多倍体西瓜育种的新时代。1947年木原均、西山市三发表“利用三倍体的无籽西瓜之研究”，正式宣告了三倍体无籽西瓜的育成。我国内地从20世纪50年代末开始多倍体西瓜的研究，虽起步晚但发展快、成绩显著。江苏省农业科学院最早开始进行多倍体西瓜育种工作，1957年首次诱变成功我国第一个四倍体西瓜华东24四倍体，并以之为母本获得三倍体无籽西瓜新秋3号。1963年中国农业科学院果树研究所瓜类室育成无籽西瓜品种无籽3号[1]。

1 西瓜多倍体诱导途径

1.1 自然突变形成多倍体

自然突变有无性和有性两种方式。无性方式是自然界的二倍体在减数分裂过程中偶然发生的染色体加倍而产生多倍体，然后通过选育手段和繁殖手段培育成多倍体植株，如芽变。有性方式是小孢子母细胞或大孢子母细胞减数分裂过程中染色体未减数形成了2n配子，经杂交或直接形成多倍体种子产生多倍体植株。一些自然现象如雷电、空气、温度剧变、土壤中的化学物质，西瓜植株创伤等有时能诱发多倍体。但自然突变的发生频率低，生产上主要利用人工诱导。

1.2 人工诱导获得多倍体

①物理方法诱导 高温、低温、离心、超声波和射线等都可诱导多倍体形成。但此类方法由于诱导率低、嵌合率高、为害性大（射线）而逐渐被淘汰[2]。

②化学方法诱导 与物理诱变相比，化学诱变育种具有用时短、后代稳定快、方法简便、易推广等优点。化学方法诱导是主要利用化学药剂（如秋水仙素、吲哚乙酸、有机砷制剂等）进行诱导，目前主要应用秋水仙碱，它能阻止正在分裂的植株细胞内纺锤丝形成，但在药效消失后又能恢复常态，重新进行分裂而形成多倍体。传统的秋水仙碱诱导多倍体的方法主要有：浸泡法、滴芽法、羊毛脂涂抹法。用秋水仙碱诱导多倍体，一般要注意药剂浓度、处理时间、细胞分裂时期和植物生长的一般状况。其中处理浓度和时间是关键，处理西瓜的有效浓度为0.2%～0.4%。经秋水仙碱处理后，一般变异率只有1%左右[3]。

另外，除草剂类药剂也取得了较好的效果。二硝基苯胺类除草剂作为染色体加倍的诱导剂，是通过干扰纺锤体形成而抑制细胞分裂中期的有丝分裂，在离体染色体加倍情况下对微管蛋白的作用比秋水仙素更有效[4]。张兴平[5]以抗微管形成的除草剂在西瓜染色体加倍上进行了试验研究，认为秋水仙碱并非最佳加倍诱导剂；用低浓度的（15～30 μmol）重氮除草剂（如Oryzalin）也可有效诱导西瓜染色体加倍，而且这类除草剂与纺锤丝蛋白的结合专一，对染色体损伤小，引起其他变异的几率比秋水仙碱小，在这些再生植株中不存在嵌合体和植株生长延迟现象。阎志红等[6]以3种二硝基苯胺类除草剂：胺黄灵、二甲戊乐灵和氟乐灵作为诱导剂，在离体条件下进行西瓜四倍体的诱导，诱导率比秋水仙素高。

诱导方法可分为活体诱导和离体诱导两种。活体诱导处理部位为种子、幼苗茎尖、幼苗生长点等，诱变率一般在0.1%～1%。谭素英等[7]通过剥去生长点外幼叶后用1%秋水仙素的羊毛脂膏涂抹和0.2%的秋水仙素水溶液浸芽处理，变异频率分别达到61%和52.6%，显著提高了西瓜变异频率和秋水仙碱处理效果。徐道娜等[8]对3个二倍体西瓜种质进行秋水仙素滴苗、不同苗态摘心、低温等综合处理诱变多倍体。结果表明，通过对各个单因素进行试验，秋水仙素浓度为0.2%～0.4%，对西瓜幼苗进行摘心处理诱变能显著提高多倍体的诱变率。但传统的活体诱导处理方法具有诱变率低、嵌合率高，且获得的四倍体植株稔性低，并可能发生回复突变等缺点，而离体培养过程中应用诱变剂的诱导技术能够克服活体诱导技术的缺点。马国斌等[9]把8 d左右苗龄的茎尖，接种在含有0.1%秋水仙素和较低浓度细胞分裂素的液体培养基中，处理24～48 h进行诱导，最有利于四倍体的产生。周谟兵等[10]试验结果显示，诱导西瓜四倍体较好的方法是将1 000 mg/L的秋水仙素加入到培养基中处理6 d，再接种到不含秋水仙素的培养基中使其分化成苗，四倍体的诱导率平均可达到55%。

③生物学方法 通过愈伤组织和组织培养染色体加倍获得多倍体，或是传统杂交方法，生产上用四倍体西瓜作母本，二倍体西瓜作父本进行杂交获得三倍体无籽西瓜：也可以用四倍体西瓜作父本，二倍体西瓜作母本杂交获得无籽西瓜。还可以用四倍体西瓜直接进行杂交，生产四倍体杂交一代西瓜。

2 西瓜多倍体的鉴定方法

2.1 染色体直接计数法

染色体直接计数法是最直接、最准确的鉴定方法。观察诱变株的根尖或花粉母细胞的染色体数目，西瓜三倍体染色体数目2n=3x=33，西瓜四倍体染色体数目（2n=4x=44）。郭启高等[11]在离体培养过程中，用不定芽叶尖染色体数目判断倍性，可以在组织培养早期100%检出西瓜植株倍性，且仅经预处理和固定即可涂片观察，省略了低渗、酶解等大量繁琐过程，方法简单，结果可靠，节约了大量的时间和培养基，并可根据需要将不同倍性的材料转入分化培养基中进行扩繁，更能适合工厂化高效育苗的需要。

2.2 流式细胞测定法

采用扫描细胞光度仪（也叫倍性分析仪）进行鉴定，用流式细胞测定法迅速测定叶片单个细胞核内DNA含量，根据DNA含量的曲线图推断出细胞的倍性。特别是在离体培养过程中，试管中的芽或植株很小且很嫩时，很容易决定其材料倍性，从而能快速地在试管苗时期进行染色体倍性分析。该方法可迅速测定细胞核DNA含量和细胞核大小，是大范围试验中鉴定倍性的快速有效的方法，且细胞核DNA含量不受外部因素，如光密度、植物组织水含量的影响，不受植物取材部位和细胞所处时期的限制，可以是叶片、茎根、花、果皮或种子等。如Zhang等[12]用此法来鉴定西瓜倍性，但该法测定费用较高。

2.3 细胞形态学鉴定法

刘文革等[13]利用扫描电子显微镜对不同倍性西瓜花粉粒形态进行了系统观察。结果表明，二倍体花粉多为近长球形，花粉整齐一致；四倍体花粉为圆球形，有异形花粉、粘连花粉和空瘪花粉等；三倍体花粉全部为空瘪花粉。谭素英等[7]研究发现，西瓜叶片保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。 Sari等[14]、Mccuistion 等[15]报道，根据保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的数目，可以有效区分倍性。Compton等 、刘文革等[17]用二乙酸盐荧光黄涂抹在西瓜离体幼叶的下表皮上，在显微镜和紫外光下观察保卫细胞叶绿体的荧光，二倍体和四倍体的每对保卫细胞的叶绿体数目平均为9.7和17.8。Cohen等[18]认为用气孔长度比其他方法都简单易行，不需要昂贵的设备，仅需要用胶带揭掉表皮，用塑料印膜印记即可，采用测定气孔保卫细胞的大小与染色体数目检验法相结合的方法，可以快速准确地筛选出加倍植株。

2.4 分子生物学鉴定法

随着分子生物学技术的发展，人们开始从分子水平入手研究多倍体，对其倍性、来源进行鉴定。目前分子技术主要应用在西瓜多倍体育种中植株种子材料的选择、幼苗的纯度鉴定等领域。刘文革等[19]以蜜枚和JM西瓜品种的纯合二倍体及其人工诱导的同源四倍体、三倍体为材料，对不同倍性西瓜AFLP标记的分子遗传变异进行了比较。其中，蜜枚品种西瓜具有3条多态性的条带，四倍体、三倍体和二倍体各有一条特异带；JM西瓜具有7条多态性的条带，3条为M4x特有带，2条为 JM3x特有带，2条为JM2x特有带。刘文革等[20]以蜜枚和JM西瓜品种的纯合二倍体及人工诱导的同基因型的同源三倍体、四倍体植株为材料，对其植株叶片的光合色素进行了测定。结果表明，按单位鲜质量测定光合色素，2个品种的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量总的趋势是随着染色体倍性的增加而减少，不同染色体倍性之间差异显著；而叶质量、单叶面积、单位叶面积的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量是随着染色体倍性的增加而增加。

2.5 杂交鉴定法

利用反交法，以待鉴定的诱导植株为母本，已知二倍体植株为父本进行套袋隔离杂交，单瓜留种，结果表明：采用杂交鉴定法判断四倍体变异株的准确率达到100%。而且利用此法当代即可确认四倍体并获得三倍体，可以免去工作繁琐复杂的染色体记数法[21]。

2.6 植株形态学鉴定法

形态学鉴定法又称间接鉴定法，是最直观的鉴定方法。湖南农学院遗传、蔬菜教研室在1980年报道，多倍体西瓜幼苗表现粗壮，节间较短，分枝力差；叶片钝圆，小而厚，茸毛较多，颜色深，叶缘多锯齿；花色较浓，花粉粒较大，孕性较二倍体低，有的甚至完全不孕，抗性增强，外果皮增厚，果实比二倍体小，呈圆形或多角形，果肉厚，肉质较紧密；种子少而大，种仁不饱满，脐部宽，种皮厚且硬[22]。龚由澜等[23]曾比较得出，新诱变成的西瓜四倍体的叶片厚度比诱变亲本二倍体的叶片厚度大2.43倍。Compton等[24]研究发现子房直径、雌花的花瓣和花粉囊直径、叶长与叶宽是西瓜倍性水平高低的标志，四倍体子房直径是二倍体子房直径的1.4倍。

2.7 逆境胁迫法

郭启高等[25]利用增殖系数法、高温胁迫法（50℃，10 h）和低温胁迫法（0℃，5 h），检出倍性平均符合程度分别为88%，90%，80%。本法省掉了独立的单株倍性鉴定过程，只需对大批量的再生苗一次性地做短时间处理后，即可检出四倍体，体现了早、快、好、省的优点。在检测的同时，还能快速扩繁出大量四倍体再生苗，尤其对增殖系数法来说，扩繁出的二倍体还可做为三倍体无籽西瓜杂交翻种的亲本。可谓是一条西瓜多倍体工厂化育苗的快捷之路。

3 多倍体西瓜的研究及应用

3.1 多倍体西瓜的研究

①品质研究 程志强等[26]以10个西瓜品种的二倍体及其人工诱导的同源四倍体、三倍体为材料，研究了不同倍性西瓜成熟果实VC含量的差异及果实发育过程中VC含量的变化。结果表明，不同倍性西瓜中VC含量差异较大，9个品种三倍体或四倍体的VC含量高于二倍体（P<0.05）；不同倍性西瓜果实发育过程中VC含量变化规律基本相同，幼果期较高、果实膨大期较低、成熟期较高且呈近似“V”形变化曲线。其峰值的出现顺序为2x、3x、4x，倍性越高，其峰值出现越晚。不同染色体倍性西瓜果实VC含量较高的时期均为成熟期。

②耐盐性研究 刘文革等[27]用NaCl琼脂固定法对蜜枚西瓜二倍体、三倍体、四倍体在不同浓度NaCl胁迫下发芽种子成苗率、下胚轴长、根长、侧根数等指标进行了测定，在30～60 mmol/L低浓度下，不同倍性西瓜所测指标都比对照高，低浓度盐分胁迫，有助于根系和幼苗生长，倍性之间没有明显差异；在90 mmo1/L以上浓度时，不同倍性之间有明显差异，耐盐性为M4x>M2x>M3x。M4x可耐受150 mmol/L浓度的盐分，M2x可耐受l20 mmol/L，M3x可耐受90 mmol/L。四倍体的耐盐程度更高些，可能和其基因剂量效应有关，三倍体的耐盐程度差，可能和三倍体种子发育不良有关[28]，其耐盐机理有待于进一步研究。

③耐冷性研究 刘文革等[29]以蜜枚二倍体及其人工诱导的同源四倍体、三倍体为材料研究了西瓜品种的不同倍性幼苗在冷胁迫下的冷害指数、细胞保护酶 （SOD、POD）及脯氨酸 （PRO）、丙二醛（MDA）的变化。结果表明，在没有冷诱导时，M4x、M3x的耐冷性不如M2x。随着冷胁迫时间的延长，SOD、POD活性都有所增加，M2x比M4x、M3x增加幅度大，最后下降。MDA含量变化呈相反的趋势。M2x的体内活性氧积累少，表现出比多倍体耐冷。PRO含量变化M2x、M3x先上升，4 d后表现下降，M4x的PRO含量从开始就表现下降，四倍体的耐冷性降低可能是细胞的生理状况的改变诸如水分含量的增加引起的。

3.2 西瓜多倍体的应用

①三倍体无籽西瓜的培育 多倍体育种在西瓜上应用最广泛，成效也比较明显，最显著的为三倍体无籽西瓜的培育。我国进行多倍体西瓜培育最早的是江苏省农业科学院，于1957年首先育成了华东24号四倍体西瓜，并配制三倍体无籽西瓜新秋3号。1961年后中国农业科学院果树所和郑州果树所也进行了四倍体和三倍体西瓜的选育，现已育成的四倍体品种（系）和三倍体品种已超过100个。由于三倍体西瓜无籽的特点，到目前为止培育三倍体无籽西瓜仍作为西瓜育种的一个目标。

②利用多倍体获得高产优质西瓜 由细胞染色体加倍而带来的性状变化是非常有利的。多倍体最明显的特征是“巨大性”，生产上利用多倍体可以提高产量和品质、增加抗病抗逆能力；西瓜通过人工诱变成为四倍体后，某些性状比二倍体更加优越，例如果皮增厚不易开裂，更耐储运；甜度增加；植株维持绿色的时间更长；果肉中营养物质含量提高等。番茄红素是一种有较强的防癌抗癌作用的类胡萝卜素。Perkins等人对不同倍性西瓜中的番茄红素含量测定结果表明，三倍体红瓤无籽西瓜中番茄红素含量显著高于二倍体红瓤西瓜。在多倍体抗性方面，可进行耐盐性、耐低温、抗病品种选育，例如枯萎病是西瓜生产上一种毁灭性病害，三倍体和四倍体西瓜对枯萎病表现出较高的抗性。

③种质材料创新 由于染色体结构和数量的变异以及基因突变，四倍体西瓜及原始四倍体在若干世代中分离出的不同类型均是重要的种质资源。在西瓜的多倍体育种中，已获得了西瓜四倍体的短秧系、无缺刻叶系、黄系、无杈系、雄性不育系等种质材料。

4 前景展望

①多倍体育种、远缘杂交与组织培养相结合。多倍体育种与远缘杂交相结合，向来被育种家推崇为一种好的育种途径，但远缘杂交的不育性和常规人工诱导多倍体的困难限制了这种结合的进行，随着组织培养技术日臻成熟和完善 （如细胞培养、胚胎培养和体细胞杂交等技术的成熟），使得多倍体、远缘杂交和组织培养三手段的结合成为可能，并显示出巨大的潜力。原来不能利用的野生资源得以利用，而由于染色体的加倍量变引起质变，常规育种资源得以创新。许多优良基因经过重组和加倍可以结合于同一品种中。不同方法的结合并用，取长补短，从而推动了科研工作的发展。

②由于多倍体基因和基因组的变化会导致基因表达发生相应的变化，目前我们还不完全了解改变基因表达的机制以及它们对进化的影响。而且只有对基因表达变化的研究更加详细，才能发现很多多倍体中新的变异的动力学及其对多倍体进化的影响。

③在生物多倍体诱变方法中，采用物理、化学、生物等方法相结合进行多倍体诱导的报道不多见，新方法的采用也很少报道，这些方面的研究值得深入。

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