茄果类蔬菜小孢子培养研究进展

王晓静，梁燕

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌，712100）

花药和游离小孢子培养是诱导单倍体植物的重要方法之一。把小孢子从花药中分离出来进行培养，即小孢子培养或游离小孢子培养。与植物花药培养相比，小孢子培养排除了花药壁和绒黏层的影响，便于分析研究[1]。小孢子属于单倍体，一方面易于诱变；另一方面，无论是发生显性突变还是隐性突变，均可在当代表现出来，易于鉴定和选择；加之，单倍体植物加倍之后即成为纯合二倍体，易于目标性状的固定和遗传；同时，小孢子培养还具有周期短、不受气候条件影响等优势。就茄果类蔬菜目前的研究状况看，在种质材料和研究方法上基本实现了世界范围内的交流与共享，未被利用的资源日益减少；另外，随着人们生活水平的提高及生产和研究过程中各种新问题的不断出现，对新品种新材料的要求越来越多样化，品种的更新速度加快。因此，小孢子培养受到育种家的高度重视。

小孢子培养始于20世纪70年代初，Nitsch和Norreel首先报道了烟草的游离小孢子培养[2]，随后，Kyo和Harada建立了烟草的游离小孢子高效产生单倍体植株的方法[3]。在茄果类蔬菜中，番茄小孢子培养开展较早，1971年Sharp首次进行了番茄小孢子培养[4]，之后对茄果类蔬菜的小孢子培养研究陆续展开，在培养技术和方法方面做了探索和积累。下面从影响茄果类蔬菜小孢子培养的因子和小孢子培养技术两方面进行概述。

1 茄果类蔬菜小孢子培养影响因子

1.1 供体植株基因型

基因型是影响游离小孢子培养的关键因素，是小孢子胚胎发生启动与否的内在因素。其影响包括：产生单倍体的途径、发生的频率、形成的时间、植株的再生能力以及所形成植株单倍体和二倍体的比例等[5]。同一物种的不同亚种乃至品种在诱导率上也表现出极大的差异。Krueger-lebus培养栽培番茄的小孢子发现有的品种没有球形胚出现[6]。袁亦楠等对夏露地番茄的小孢子进行培养，只有薯叶番茄有反应[7]。宋彦平等对茄子小孢子进行培养发现，11份供试材料中有7份材料获得了愈伤组织，且愈伤组织形成的时期和数量存在明显差异，最好的每蕾达到0.86个，且所需时间较短，20 d左右即可形成肉眼可见的愈伤组织[8]。

1.2 供体植株的生理状态

供体植株的生理状态，包括植株的发育阶段及生长环境对小孢子培养时的胚胎发生具有很大影响。宋彦平等[8]研究发现，茄子在盛花期（植株主花枝和一级侧枝的花蕾少量开花到一级侧枝的花蕾已有开花之前）采摘的适宜花蕾，胚诱导率最高，始花期诱导率有所下降，末花期更低。小孢子的诱导率还与供体植株的成长条件有密切的关系。Nitsch[9]的研究结果表明，将栽培番茄和细叶番茄的生长温度控制在22℃（昼）/20℃（夜），能将小孢子培养至子叶胚阶段。张子君等[10]在对辣椒小孢子培养的过程中发现，在日温25℃左右、夜温13℃左右的环境中生长的植株，其再生植株诱导频率最高，日温超过30℃时，诱导频率下降。另外，对供体植株施行氮饥饿及植物生长调节剂（如NAA）处理，可提高烟草小孢子胚的诱导率[11]。有人认为这些条件改变了植物体内的营养合成或运转，使处于发育中的小孢子由于遭受氮饥饿，偏离了配子体方向而向孢子体方向发展。

1.3 花粉的发育时期

被子植物的花粉发育历经四分体时期、单核期（小孢子阶段）、双核期和三核期（雄配子体阶段）四个阶段，单核期又可分为单核早期、单核中期、单核晚期[12]。一般所处发育期越早的花粉，对培养条件的要求越苛刻，且培养效果不一定好。就多数植物而言，单核中期至晚期的花粉最容易形成胚状体或愈伤组织。同样，对于茄果类作物，最适合小孢子培养的时期是单核期到双核期，特别是单核后期。连勇等[13]在茄子小孢子培养的试验中观察到仅单核期的小孢子有分裂现象，并在随后的诱导培养中得到大量愈伤组织。另外，由于发现小孢子发育时期与花蕾的长度有一定的关系，所以通过花蕾的长度来判断小孢子发育时期是常用的方法，王烨等[14]认为，进行辣椒小孢子培养时选择花蕾的标准是：花蕾的萼瓣等长或瓣稍长于萼，并且内部花药尖端微紫。各个品种的花蕾在这个发育阶段时其内部的小孢子大部分处于单核期。但是花蕾的大小与供体植株的基因型、生长条件以及花蕾在植株上所处的位置有关，因此，要想成功的进行小孢子培养，就必须了解小孢子在特定环境下的发育状况，对小孢子进行镜检，将细胞学观察与植物学相结合进行取材。

2 茄果类蔬菜小孢子培养技术

2.1 预处理

在游离小孢子前对花蕾或花药进行预处理，有利于提高小孢子胚的诱导率。这主要是从形态上改变其极性分布，从生理生化上改变其细胞生理状态，从而使小孢子偏离正常的配子体发育途径，经过不断地细胞分裂，形成胚状体或愈伤组织，最终成苗[15]。预处理方式主要包括低温（通常4℃）、高温（通常36℃）、甘露醇、秋水仙素、无碳源、射线等。Duncan等[16]认为，低温可以延缓花粉的退化，使更多花粉有可能开始新的细胞周期。Burgin等[17]用低温处理烟草花蕾后，小孢子分裂指数上升。袁亦楠等在番茄游离小孢子培养中发现，供体植株处于低温环境下，小孢子类胚发生率提高。Rotino等[18]验证了温度的高低及处理时间长短都对愈伤组织的诱导率有显著影响，高温处理或低温和高温交替进行的变温处理对茄子愈伤组织的诱导都有一定的效果。Nitsch等用3℃的低温处理细叶番茄花蕾48 h，可以明显提高两核花粉粒的百分率。王烨等[14]对5个不同的辣椒品种进行甘露醇预处理发现浓度为10 g/L时，小孢子存活率有所提高。Miyoshi[19]研究结果表明，饥饿处理对于茄子雄核发育的启动有较好的效果。

2.2 培养基

①基本培养基 培养基的选择是关系到成苗与否的一个重要因素。对于游离小孢子培养的基本培养基成分，不同的作物有不同的要求。就目前的研究，用于分离小孢子的分离液主要借鉴于原生质体的分离液，培养基主要借鉴同种植物花药培养的培养基。辣椒上应用的培养基有MS、H、NTH、B5、Nitsch、N6等[20]，其中MS和NTH取得了较好的效果。茄子小孢子培养应用的培养基有 KM、MS、NLN、C、R等，其中以KM的效果较好且应用广泛[21]。番茄小孢子培养应用到MS、HN、PM以及MH等培养基[22]。

②碳源 糖的种类和浓度对培养基的渗透压起决定作用。应用于小孢子培养的碳源主要包括蔗糖、葡萄糖和麦芽糖。马欣等[5]对茄子培养的试验结果表明，葡萄糖在3种糖中的效果最好。王烨等[14]对辣椒小孢子进行了3种糖的处理，发现3%的麦芽糖效果最好。周广栋等[23]用3%的蔗糖诱导不同品种的番茄，收到一定的效果。在游离小孢子的培养基中加入高浓度的蔗糖对胚的形成会产生抑制作用。一般认为，茄科植物游离小孢子培养所需的碳源浓度都较低，范围在2%～4%。

③有机添加物 在小孢子的发育过程中，培养基中的有机物成分是必不可少的，它们有利于胚胎的发生。王立浩等[24]研究发现硝酸银可以减轻辣椒组织培养中材料的褐化程度，促进胚状体的发生。活性炭加入培养基，通过平衡培养基中元素比例进而促进胚状体的形成[25]。王玉英等[26]认为添加0.5%的活性炭是有益的。王烨等[14]的研究表明，水解酪蛋白、Vb1、谷氨酰胺、活性炭和硝酸银这4个因素在小孢子发生愈伤组织和成胚的过程中都起着非常重要的作用。在茄子小孢子培养中常用花药壁与小孢子进行短期的共生培养。范适[27]用花药壁残渣与茄子游离小孢子共生培养7 d，取得了较好的试验效果。马欣[28]进行了茄子花药壁和子房与小孢子的共生培养，结果花药壁与小孢子共生培养7 d获得了大量的愈伤组织。

④激素 在小孢子培养过程中，激素的种类及配比是影响诱导频率的又一个关键。6-BA、KT、NAA、IAA、2，4-D等不同浓度的配比都曾试用在茄果类的小孢子培养中。Matsubara等发现[29]，在MS培养基上附加KT 0.02 mg/L+2，4-D 0.004 mg/L可诱导胚状体高频率发生，当附加2，4-D 0.03 mg/L+KT 0.1 mg/L时则诱导愈伤组织高频率发生。宋彦平等[8]以KM为基本培养基，附加不同浓度激素，研究激素浓度对茄子愈伤组织诱导的影响，结果表明，最适宜的组合为0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L ZT+1.0 mg/L NAA。然而，袁亦楠在对番茄的小孢子培养试验中发现，在不加激素的培养基上与加了IAA的HN培养基相比，一样能诱导类胚状体的形成，似乎类胚状体的形成与激素无关，但是以往的试验报道及试验发现愈伤组织的形成无一例外是发生在含有激素的培养基中。

⑤培养条件 植物离体培养的条件包括温度、湿度和光照。由于采用液体培养基，容器内的相对湿度几近100%，所以主要是调控培养温度和光照。不少植物的小孢子在较高温度下培养效果较好，特别是最初几天经历一段高温培养出愈率会明显提高。对于茄果类蔬菜，在32℃左右培养8～10 d，然后转入25～28℃培养较为适宜。短期的高温培养不但可以提高出胚率，还有利于愈伤组织的绿苗分化。在培养过程中前期主要采用黑暗培养，后期进行适当的补光，因为黑暗有利于愈伤组织的生长，但长期黑暗会明显降低愈伤组织的品质和外观[30]。

3 茄果类蔬菜小孢子培养的现状与展望

综上所述，就茄果类蔬菜小孢子培养研究结果而言， Supena 等[31]、Miyoshi[32]、高秀云等[23]分别获得了辣椒、茄子、番茄的小孢子再生植株，但数量极少。目前茄果类蔬菜小孢子培养获得再生植株的报道很少，大多试验停留在愈伤组织或类胚状体阶段。存在的主要困难是小孢子会在游离后迅速大量死亡，小孢子胚诱导频率低，胚状体发育能力差，难以分化形成小植株。

就培养技术研究而言，由于茄果类蔬菜的小孢子培养技术难度大，发展非常缓慢，目前大多试验主要研究的是材料的预处理方式和培养基中添加物的成分及浓度两方面的内容。

茄果类蔬菜小孢子培养已经取得了一定的进展，针对目前研究中存在的问题，今后应该从基础理论及试验技术2方面着手，尤其是对取材时期、激活处理方法、培养基成分、生长环境下小孢子发育的生理机制等进行更加深入的研究，以期建立一个系统而又完善的小孢子培养技术体系。鉴于单倍体育种的显著优势，相信茄果类蔬菜小孢子培养技术将在基础研究领域发挥更大的作用，与此同时，也为茄果类蔬菜品种资源的不断更新提供有力的技术支持。

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