鸡Toll样受体研究进展*

甘珊珊,何秀苗*,韦 平

(1.广西民族大学,广西南宁 530006;2.广西大学,广西南宁 530004)

鸡Toll样受体研究进展*

甘珊珊1,何秀苗1*,韦 平2

(1.广西民族大学,广西南宁 530006;2.广西大学,广西南宁 530004)

Toll样受体(TLRs)是一类典型的模式识别受体(PRR),是先天性免疫系统中的细胞跨膜受体以及病原模式识别(PAMP)受体之一。在鸡体中发现的TLRs(chTLRs)已经超过10种,其在进化中趋于保守,能识别保守的微生物成分。TLRs对病原相关分子模式的识别不仅在先天性免疫中有重要作用,还能够有效地启动获得性免疫。论文对部分 TLRs在鸡体中的分布及参与激活获得性免疫途径的研究进行综述。

鸡;Toll样受体;先天性免疫;获得性免疫

*通讯作者

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是近年来发现的先天性免疫跨膜受体和信号转导受体,是病原模式识别(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)受体之一。在鸡体中发现的TLRs(chTLRs)分子已超过10种。TLRs分布于鸡的不同器官、组织和细胞;由于参与不同的免疫应答,不同的TLR在鸡体中的表达丰度(abundance)也不相同。TLRs分子在病原识别中具有重要作用,每一种TLR能够识别不同病原体所携带的特异分子配体。在鸡体中已发现 TLR1(包括两个亚型分别为chTLR1t1和chTLR1t2)、TLR6及 TLR10有相同的识别功能,主要识别革兰阳性细菌的脂蛋白和肽聚糖;TLR2(包括两个亚型分别为 chTLR2t1和chTLR2t2)、及 TLR4主要识别病毒的蛋白成分;TLR5主要通过细菌的鞭毛而识别细菌病原体;TLR3、TLR7、TLR8及TLR9主要识别病毒的核酸成分;TLR15及TLR21主要参与鸡的某些疾病的预防。chTLRs与哺乳动物的TLRs系统既有联系又有区别,是一种适应周围环境不断变化和进化的结果。通过TLRs,机体能够识别病原相关分子模式并刺激细胞因子生成,上调吞噬细胞中共刺激分子的表达,活化T细胞,在先天性免疫与获得性免疫之间建立一个紧密相连的桥梁。因此,它是保护机体健康的重要卫士。本文将对chTLRs结构和功能及其疾病发生及免疫等方面的研究进展做一概述。

1 TLR的结构及功能

TLR由胞外区、跨膜区及胞内区三部分组成。胞外区为富含亮氨酸重复序列(1eucine rich repeats,LRR)的结构域,其特征是亮氨酸间隔分布于几个固定位点,此结构的LRR有利于促进蛋白质间的相互黏附,因而被认为可用来识别病原微生物或其他产物,激活胞内信号转导系统。研究显示,存在于不同物种的多种含LRR的蛋白都参与宿主对病原体的防御反应;胞内区由 Toll同源结构域(toll homoly domain,TH domain)和分子羧基端长短不同的短尾肽组成,该序列与白细胞介素1(intedeukin-1,IL-1)受体胞内区的保守序列有高度同源性,于是又将T H结构域称为 Toll/IL-1R(TIR)同源区,它是Toll样蛋白向下游进行信号传导的核心元件,这一区域关键位点的突变或序列缺失将阻断信号向下传递。TLR一旦被PAMPs激活,即可触发细胞信号级联,最终激活转录因子NF-κB的信号途径从而激活细胞,启动一系列免疫炎症反应,以清除入侵的病原微生物。这些效应包括产生多种能扩大免疫炎症反应、增强杀菌作用的细胞因子如IL-1、IL-6、IL-12、IL-8、TNF-Q 及 IFN-7等。越来越多的证据表明,激活的 TLRs也为建立特异性免疫提供了条件。

2 鸡TLRs的研究

2.1 TLR1

Iqbal M等[1]通过RT-PCR的方法对鸡的七种TLRs的mRNA在组织及不同细胞类型的细胞中的相对含量进行测定。结果发现,TLR1在鸡的大多数组织中都有表达,在鸡的脾脏和肝脏中表达水平最高。其他受体分别在不同组织、细胞类型中有不同程度的表达。研究为更好的解释鸡的不同受体在参与不同病原体入侵时的免疫诱导机制提供了分子依据。

Lu Y等[2]对感染产气荚膜梭菌的白肉鸡Toll样受体基因的表达进行研究。结果表明,TLR2家族成员对产气荚膜梭菌的应答最为明显,其中TLR2二型(chTLR2t2)和 TLR1一型(chTLRt1)的基因表达与脾脏组织中信号接头分子 MyD88、T RAF6以及 TRIF密切相关。说明了chTLR1和chTLR2参与了感染产气荚膜梭菌的鸡在时间及空间上的动态先天性免疫过程。

2.2 TLR2

TLR2多在髓源性细胞上表达,即分布于除T、B和自然杀伤细胞(NK)外的免疫细胞,主要表达于包括单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等宿主第一线防御相关的细胞,尤其在脾脏和外周血白细胞中有较高水平的表达。TLR2涉及各种不同病原成分的识别,包括病原体的脂蛋白(BLP)、革兰阳性菌的脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(PGN)、分支杆菌的阿拉伯甘露聚糖脂(LAM)、真菌的酵母聚糖以及螺旋体的糖脂类等。TLR2被配体激活后,通过非依赖MyD88的信号通路传导信号。

Iqbal M等[1]研究表明,chTLR2的翻译表达较别的受体有所限制,其主要表达在一些非免疫器官和细胞中。如chTLR2-1没有chTLR2-2表达得广泛,前者仅仅在脾脏、盲肠及肝脏组织中有中丰度的表达,而在大多数细胞如异性白细胞和 T细胞系表达受限[3]。chTLR2-2在B细胞和部分CD8+T细胞中表达水平较高。同一受体在不同细胞中表达程度不同可能与细胞的性质、结构以及来源等因素有关,为进一步研究TLR2参与鸡的特定病原分子识别提供理论依据。

Higuchi M 等[4]研究了chTLR2和chTLR1亚族对细菌的BLP和PGN的联合识别作用。他们克隆了chTLR1和chTLR2基因,序列分析后发现chTLR1和chTLR2各自分别编码2种氨基酸,即chTLR1t1和 chTLR1t2、chTLR2t1和 chTLR2t2,将它们转染人胚肾细胞HEK293后检测核转录因子(NF-κ B)的产生情况。结果发现 chTLR2t1和chTLR1t2协同对PGN发出免疫应答,联合chTLR2t1和chTLR1t2能够有效的识别BLP,接着巨噬细胞可以激活脂蛋白 2 ku(Malp-2),而chTLR2t1和chTLR1t1联合却无法识别Malp-2,并且单独的任何一种受体均无法识别Malp-2,也就无法激活NF-κ B。这说明受体之间的相互联合作用在免疫应答方面发挥重要作用。这也提示其他受体之间的联合和排斥作用对免疫应答的影响有待进一步研究。

2.3 TLR3

TLR3普遍表达于心、脑、肺、肌肉、胎盘和胰脏组织中。此外,TLR3的定位和调节不仅在不同类型的组织中不同,在不同细胞中也是不同的。Iqbal M等[1]研究发现,chTLR3在鸡肾细胞(CKC)和鸡胚成纤维细胞(CEF)中表达水平最高。由于chTLR3介导病毒的免疫反应,因此,推测chTLR3会在富含CD8α、TCR1、CD8+等细胞因子的巨噬细胞、淋巴细胞、脾脏B和T细胞系有较广泛的表达。但用RT-PCR却不能从富含CD8α和TCR1细胞因子的外周血单核巨噬细胞中检测到chTLR3的mRNA。

TLR3主要专一性识别双链RNA(dsRNA),通过依赖MyD88的信号通路及不依赖MyD88的信号通路,诱导 NF-κ B的转位以及 IFN1和 IFN2的表达,促发前炎症因子及辅助刺激分子的释放,调节机体细胞非特异性的防御反应。许多病毒在感染细胞后,在其复制或转录的过程中就启动了dsRNA的合成,感染病毒的濒死细胞会释放dsRNA,dsRNA作为一种PAMP,能够特异性的被TLR3识别,引起宿主细胞的抗病毒应答,这些dsRNA就会成为感染状况的预警指标。此外,TLR3还能够提高对抗病毒感染有重要作用的IFNβ的产生量。因此,TLR3对阐明病毒感染机制有着重要的意义。

施蕾[5]通过荧光RT-PCR技术研究了鸡胚成纤维细胞(CEF)中 TLR3在鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染过程中的作用。结果发现CEF被病毒感染后,chTLR3基因转录水平上升明显高于正常细胞。在另外一个试验中,设计针对chTLR3的干扰RNA(siRNA)转染CEF细胞,然后感染病毒并测定成熟病毒颗粒释放情况。结果显示,经转染siRNA后又被病毒感染的细胞的 TLR3基因表达水平低于直接用病毒感染的细胞而高于正常的细胞;同时TLR3基因沉默以后,细胞病毒滴度低于直接感染病毒的细胞滴度。这表明TLR3基因的沉默可影响IBDV的复制及成熟病毒的释放,从翻译水平上证实了chTLR3在IBDV的感染中起重要的作用。这为进一步研究感染IBDV的鸡如何启动TLR3信号传导机制使之参与到免疫调节提供参考,最终为寻找新型的抵抗IBDV感染方法提供了新的科学思路。

Adam J等[6]通过给鸡注射poly(I:C)和dsRNA类似物均能够引发类似于哺乳动物体内的一型IFN增加,从而激发chTLR3的上调。并且还通过使用干扰RNA介导基因沉默的试验表明,被poly(I:C)刺激后的鸡体对IFNβ的表达均涉及到TLR3的信号传导,进一步证明了TLR3在参与poly(I:C)激发的免疫应答中的重要作用。此外,chTLR3的作用还可以在被H5N1禽流感病毒感染鸡体内TLR3和IFNβ表达增加这个例子中得到证实。因此,chTLR3在抵抗鸡的病毒感染方面发挥着关键的作用。

2.4 TLR4

TLR4分子主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多形核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞等表面。Iqbal M等[1]的研究发现,其mRNA主要在富含巨噬细胞的组织中表达水平较高。TLR4主要对革兰阴性菌的脂多糖(LPS)、BLP、LTA及一些真菌、病毒等病原体的识别,其信号传导机制基本相同。

TLR4对LPS的识别及其信号转导[7]主要包括:MyD88通过C-端的TIR区域与TLR4胞内的TIR区域结合,作为接头蛋白招募受体相关激酶(IRAK);IRAK结合泛素连接酶6(TRAF6)并活化转化生长因子β激酶1(TAK1);TAK1引发核因子κ B(NF-κ B)激酶(NIK)的活化,接着激活核因子抑制蛋白(Iκ B)酶复合物,形成活化的Iκ B激酶(IKK)复合体即IKKα IKKβ,作用于Iκ B使之泛素化而降解。此外,TRAF6还可以结合Toll途径的进化保守信号转接蛋白(ECSIT),激活丝裂原活化蛋白(MAP)途径,从而活化NF-κ B和激活蛋白(AP)1;然后激活细胞因子例如IL-1、IL-6和IL-8等基因转录,并促进B7家族成员表达,进而通过抗原递呈细胞(APC)活化T淋巴细胞,启动获得性免疫[8]。

Ozoe A等[9]给母鸡静脉及产道注射LPS后,通过半定量RT-PCR检测鸡输卵管中chTLRs的表达模式及产道中chTLR4的变化情况,通过免疫组化检测细胞中chTLR4表达蛋白的数量。结果显示,六种类型的 TLRs即 TLR1、-2、-3、-4、-5 和-7 在鸡的输卵管中均有表达;TLR4主要定位于黏膜表面的上皮细胞以及基质间的表皮细胞;相对于输卵管,在产道中每一种chTLR均有较高水平的表达。静脉注射LPS提高了TLR4的表达量且增加了在产道中TLR4-免疫阳性细胞的数量。此外,产道黏膜细胞中白细胞数量增多,相应的TLR4表达增强。因此,母鸡中的TLR4在识别微生物以刺激宿主的先天性免疫信号的级联放大具有重要的作用。

沙门菌主要危害幼年鸡,以腹泻和脱水为主要症状从而导致鸡的死亡,这给家禽业带来巨大的损失。Leveque G等[10]研究了chTLR4等位基因的多样性与鸡对沙门菌的易感性之间的关系。发现chTLR4与人的TLR4(hTLR4)蛋白有64%的同源性,而与TLRs别的家族成员有41%的同源性。通过Northern blot分析表明,chTLR4在脑、胸腺、肾脏、大肠、肌肉、肺、心脏和脾脏等表达水平相当。并且发现鸡的染色体中含有沙门菌易感基因,而chTLR4等位基因的多样性与鸡对沙门菌的抗性之间有重要的相关性。这为制定预防鸡的沙门菌感染提供重要策略和思路。

2.5 TLR5

Iqbal M等[1]发现,chTLR5的mRNA在鸡的肾细胞(CKC)和CEF中有较高水平表达,但在巨噬细胞中表达量低于别的细胞亚群,而在颗粒白细胞中表达水平较高。

Keestra A M等[11]成功克隆chTLR5基因并将其表达于HeLa细胞中,然后用肠炎沙门菌感染细胞。结果发现,细胞通过识别鞭毛而激活NF-κ B的表达。通过鼠肠炎沙门菌鞭毛的单氨基酸突变的研究证实,所突变的氨基酸位点对于chTLR5特异性识别肠炎沙门菌具有关键作用。进一步说明了细菌中单氨基酸的替换可以改变 TLR5的种属特异性,而这个变化可能引起宿主对相关感染易感性的改变。

2.6 TLR7

Iqbal M等[1]研究发现,chTLR7主要表达于B细胞、T细胞亚群以及树突细胞亚群,并且在中性粒细胞和酸性粒细胞中也有微弱的表达。TLR7主要识别单链 RNA(ssRNA),包括富含鸟嘌呤的单链RNA及人工合成的类似鸟嘌呤复合物。人工合成未修饰的RNA较天然RNA能够更有效地激活TLR7,而 TLR7的翻译后修饰能影响RNA与TLR7的作用。如线粒体 RNA或核糖体蛋白(snRNP)相关RNAs由于被选择性修饰或翻译后修饰水平较低,因此能较有效地激活 TLR7。除此之外,研究发现 RNA病毒需要脱去外壳或与内涵体发生融合后才能被TLR7识别。

弓莉等[12]通过给雏鸡口服不同剂量的IBDV弱毒疫苗,然后于不同时间采集脾和腔上囊组织,分离淋巴细胞并用半定量 RT-PCR法检测 chTLR7基因动态表达。结果显示,弱毒疫苗接种后chTLR7的转录明显上调并在一定时间达到峰值,随时间增加又会恢复接种前的水平。因此,推断chTLR7可能参与了IBDV感染早期的天然免疫过程。

2.7 TLR9

TLR9是典型的Toll样受体家族成员,主要存在于树突状细胞(dendritic cell,DC)、B细胞和巨噬细胞表面。TLR9自然识别的配体是细菌DNA中含有非甲基化CpG的序列。CpG是以非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为核心的回文序列,该序列在脊椎动物基因组出现的频率低于在原核生物和病毒基因组的出现频率,并且CpG多发生甲基化。脊椎动物免疫系统正是通过识别CpG特征结构来识别微生物DNA并产生针对抗原的保护性免疫反应。而CpG DNA对天然免疫细胞的影响又可诱导B、T淋巴细胞的活化增殖,使之释放IL-12、IL-6并分泌IgM;同时也可活化单核或巨噬细胞、NK细胞并促使IFN的产生。

Kristie A等[13]用TLR7和TLR9的配体刺激鸡脾细胞可以引发炎症细胞因子的释放,并促进淋巴细胞增殖。这为开发治疗禽类疾病的药物提供潜在的实用价值和策略支持。

2.8 鸡的其他TLR

鸡TLR1-10基因与哺乳动物 TLRs基因具有同源性,而目前在鸡中发现有两例TLRs具有种属特异性,它们在识别鸡的相关疾病方面有重要作用。Jessica R等[14]用鸡的易感沙门菌淋巴细胞(A)和抗沙门氏菌淋巴细胞(B)来检验chTLR15的mRNA转录水平之差异,可以初步推测chTLR15与易感染鸡品系的关系。Farnell M B等[15]将分离到的新生鸡的外周血异嗜白细胞用信号转导途径的抑制物作用,再用肠炎沙门菌的 LPS及金黄色葡萄球菌的LTA刺激,并对外周血颗粒白细胞的氧化性增加进行定量检测。结果显示,前期处理对鸡的外周血颗粒白细胞的氧化性增加有不同程度的削弱作用。显然这与两种刺激剂的信号传导途径的不同有关。Brownlie R等[16]发现了 chTLR21和哺乳动物的TLR9在识别未甲基化的寡聚核苷酸(ODN)有功能上的同源性,即在识别作为危险信号的小分子DNA从而引发先天性免疫和获得性免疫应答中具有重要的作用。

3 chTLRs的进化研究

chTLRs的相关研究还包括进化方面的研究,Temperley N D等[17]对鸡的TLRs家族在进化过程中基因增加或减少进行了相关的研究,并证实chTLRs与哺乳动物TLRs以及脊椎动物TLRs的区别,提示不同物种 TLRs的改变是不断适应环境的进化结果。同时,Yilmaz A等[18]对chTLRs的结构及进化意义进行研究发现,鸡的TLRs有相同的蛋白质二级结构。并且通过动植物的分析表明,已经被鉴定的鸡的 TLRs基因(TLR1、-2、-3 、-5、-7)与哺乳动物的具有同源性。编码鸡TLRs的富含亮氨酸的重复序列在达尔文的选择进化中有重要的作用。

4 前景展望

综上所述,chTLRs在免疫细胞、器官及组织中有较高水平表达。chTLRs是识别相关病原体参与天然免疫反应的重要受体。同时,它还在天然免疫和获得性免疫之间发挥桥梁作用。这为研究鸡乃至禽类相关疾病的预防和治疗提供理论依据,最终为制定出合理的免疫干扰策略提供重要指导,也为开发新的疫苗提供新的思路。但是,chTLRs之间的协同及抑制机制尚不清楚。因此,chTLRs在免疫中的多重作用有待进一步研究。此外,TLRs在鸡的重要传染病的预防和治疗方面的实际应用目前还不够成熟。鉴于TLRs在免疫学、分子生物学以及临床医学研究中的重要作用,chTLRs研究及其应用的前景将会十分广阔。

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Progress on Chicken Toll-like Receptor

GAN Shan-shan1,HE Xiu-miao1,WEI Ping2

(1.Guangxi University f or Nationalities,Nanning,Guangxi,530006,China;
2.Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China)

The Toll-like receptors(TLRs)of cell surface molecules represents a major kind of pattern-recognition receptors(PRR),which is one kind of the receptors of cell-transmembrane and pathogen-associated molecular patterns(PAMP)in the innate immune system.Up to now,more than ten TLRs expressed in chickens were found.One of the major evolutionary strategies of innate immunity is to recognize a few highly conserved microbial components with several conserved TLRs.The interaction of PAMPs with TLRs play a key role not only in the initiating immediate innate immune responses to prevent spread of infection,but also in the potentiating and direction of the later responses of acquired immunity.Update researches on the distribution of the TLRs in chickens and their role in the immunity were reviewed in the article.

chicken;Toll-like receptor;innate immunity;acquired immunity

S852.4

A

1007-5038(2010)09-0076-05

2010-01-20

国家自然科学基金(30860206);广西青年科学基金(桂科青0991014);广西自然科学基金(桂科自0728058)

甘珊珊(1985-),女,新疆乌鲁木齐人,硕士研究生,主要从事动物分子病毒学研究。