日本脑炎诊断技术研究进展*

裴国顺,冯若飞,2,侯兰新*

(1.西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;

2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃兰州 730030)

日本脑炎诊断技术研究进展*

裴国顺1,冯若飞1,2,侯兰新1*

(1.西北民族大学生命科学与工程学院,甘肃兰州 730030;

2.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室,甘肃兰州 730030)

日本脑炎是一种严重危害养猪业以及人类健康的虫媒病,每年造成大量的经济损失。为了更好地控制与预防该病,及时的诊断尤为重要。用于日本脑炎诊断的技术主要有病毒分离与鉴定、血清学诊断技术及分子生物学技术等。由于每种诊断技术都有其优势和不足之处,所以应根据具体情况选择合适的诊断方法。论文就各种诊断技术的原理、特点进行概述,并对日本脑炎诊断技术的发展趋势进行展望。

日本脑炎;免疫荧光;诊断;聚合酶链反应;酶联免疫吸附试验

*通讯作者

流行性乙型脑炎病毒又称日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),经蚊子(主要是三角喙蚊)传播能引起人畜患乙型脑炎(乙脑),该病最早在日本发现,是一种人兽共患的自然疫源性疾病[1-2]。本病主要分布于亚洲及西太平洋地区,在亚洲又以中国及东南亚地区流行较为严重,我国是日本脑炎流行的高发地区,除新疆、西藏和青海等地外,各省(区)均有发生[3]。日本脑炎的致死率在20%左右,重型患者病后常留有后遗症[4]。因此,对日本脑炎诊断方法的研究具有重要意义。近年来我国在日本脑炎的诊断方法上进行了不少研究,现将取得的进展概述如下。

1 病毒分离与鉴定

病毒分离与鉴定是诊断日本脑炎最确切、可靠的一种方法。通过接种JEV敏感细胞,如金黄色地鼠肾细胞、白蚊 C(C6/36)、BHK-21和Vero细胞等,观察细胞是否病变。经分离培养取得毒株,进行分子生物学等鉴定,可研究其基因型,是否本地区主要流行株或外来输入株,是否发生变异等。王俊文等[5]用BHK-21细胞成功分离到2株JEV,分别命名为 LN022102和 LN022104。

2 血清学诊断技术

2.1 传统血清学方法

2.1.1 补体结合试验 补体结合试验(complement fixation test,CFT)是以已知抗原(或抗体)和待检抗体(或抗原)作为待检系统,以绵羊红细胞(SRBC)与相应抗体(溶血素)组成指示系统。在试验过程中,补体先与待检系统反应,如果待检系统中抗原与抗体相对应,则结合形成免疫复合物,可优先结合补体,这样补体就不再与指示系统中的致敏红细胞反应,所以不发生溶血;反之,若待检系统中抗原与抗体不相对应,则发生溶血现象。因此,可以根据溶血的出现与否,定性或定量检测抗体或抗原。

2.1.2 血清中和试验 血清中和试验(serum neutralization test,SN)是利用患病动物血清中含有抗体,能与JEV结合特性,使病毒失去感染细胞的能力,从而阻断病毒的繁殖。通过对敏感细胞的接种,比较病毒受免疫血清中和后的残存感染能力,可对JEV进行鉴定。

2.1.3 空斑减少中和试验 空斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test)是一种经典的中和抗体的测定方法,灵敏度远高于血凝抑制试验,重复性较好,可真实地反映血清抗体中和JEV的能力。武果桃等[6]通过JEV空斑减少中和试验和反向被动血凝抑制试验,证明空斑减少中和试验的阳性检出率高于反向被动血凝抑制试验。

2.1.4 血凝抑制试验 血凝抑制试验(HI)是流行病学调查和临床诊断中最常用的方法,JEV感染后,HI抗体出现较早,一般在病后4 d～5 d开始出现,2周左右达到高峰,并可维持1周左右,因此测定HI抗体可用于早期诊断。

2.2 新型SPA协同凝集试验

金黄色葡萄球菌的细胞壁内含有葡萄球菌A蛋白(SPA),能与人及多种哺乳动物血清中IgG类抗体的FC段非特异性结合,IgG的FC段与SPA结合后,两个Fab段暴露在葡萄球菌菌体表面,仍保持其结合抗原的活性和特异性,当其与特异性抗原相遇时,能出现特异的凝集现象。新型SPA协同凝集试验(SPA-CoA)主要利用这一特征实现对微生物的快速诊断、定种及定型,以及传染病的早期诊断。宋大伟等[7]利用SPA-CoA试验对144份猪血清进行了JEV抗体检测,并与HI试验进行对比,结果显示,HI检测阳性率为57.63%,新型SPA-CoA阳性率为63.89%;二者阳性符合率87.00%,总符合率为88.89%,表明新型SPA-CoA比HI试验简便实用。

2.3 免疫荧光技术 免疫荧光检测法是一种将抗原、抗体的结合反应与形态学相结合的方法,该法把血清学的特异性、荧光色素的敏感性、显微镜检查法集为一体,扩大了免疫学诊断的结果。目前拥有乙脑诊断的免疫荧光技术包括间接免疫荧光法,直接免疫荧光法和微量免疫荧光法。

2.3.1 直接免疫荧光法 将荧光素标记在相应的JEV抗体上,直接与JEV反应。标记荧光素的抗体与抗原反应后,在紫外光的照射下,用显微镜可观察到荧光现象。该法具有简便、特异性高,非特异性荧光染色少等优点;缺点是敏感性偏低,且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

2.3.2 间接免疫荧光法 间接免疫荧光法(indirect fluorescent antibody test,IFA)与间接ELISA相似,引入酶标二抗,可检测抗原,也可检测抗体。它比直接法易出现非特异荧光,由于一抗可以结合多个标记二抗,故敏感度比直接法高[8]。朱兆奎等[9]用所建立的检测猪血清中 JEV IgG抗体的IFA,对50份母猪、55份仔猪和65份屠宰猪的血清进行检测,日本脑炎血清抗体效价≥1∶200的分别为88.00%,10.91%和24.62%。表明该方法能较好的用于猪血清日本脑炎流行病学调查

2.3.3 微量免疫荧光法 微量免疫荧光法(microimmunofluorescence,MIF)是 Wang S P在20世纪70年代建立的,主要用于血清流行病学的研究,对临床诊断也有极大帮助。MIF具有特异特异性强,敏感性高等优点,可对日本脑炎患者的急性期血清进行特异性检测。

2.4 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzyme techniques)的基础上发展起来的一种免疫测定技术,是一种最常用的固相酶免疫测定方法。ELISA的基本原理是用酶标记的抗原或酶标记的抗体为主要试剂,通过复合物中的酶催化底物呈色反应来对被测物进行定性或定量检测。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,ELISA可分为:捕获包被法测抗体,双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、间接法检测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原等6种类型。由于ELISA方法的快速、高效等优越性,目前该方法已经被广泛用于日本脑炎抗原或抗体检测。

2.4.1 捕获包被法测抗体 捕获法亦称反向间接法,主要用于测定血清中某种抗体亚型成分,其操作步骤为:用已知特异性第二抗体包被固相载体;加待检标本,经温育使相应抗体与固相二抗结合,洗涤除去无关物质;加入特异抗原和抗原特异的酶标抗体,温育,洗涤除去未结合的抗原和酶标抗体;加底物显色,终止反应后,用酶标仪测OD值定量[10]。

2.4.2 双抗体夹心ELISA测抗原 该法属于非竞争结合测定,它是检测抗原最常用的ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其步骤为将抗体包被到固相载体上,加入待测抗原,反应一段时间,洗去没有与抗体吸附的抗原,再加入酶标抗体,经一段时间后洗去多余的酶标抗体,加底物显色,经终止液终止后,酶标仪检测确定待测抗原。张小兵等[11]利用单克隆抗体和酶标多克隆抗体配对,用含动物血清的稀释液稀释酶标抗体,实现了对待检抗原的高特异性和高灵敏度检测。

2.4.3 双抗原夹心ELISA测抗体 把JEV抗原固定在固相上,加入待测抗体,反应一段时间后洗板,加入酶标抗原,37℃孵育一段时间再次洗板,经显色,酶标仪检测可确定是否有待测抗原。

2.4.4 间接ELISA法 此法是测定抗体最常用的方法,其原理是将抗原连接到固相载体上,待测抗体与之结合生成附着在固相上的抗原-抗体复合物,用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,加底物显色,经终止液终止后,酶标仪检测确定待测抗体。孙虹等[12]用该法对1 318份猪群血清样本进行检测,获得JEV IgG抗体阳性血清 489份,总阳性率为37.1%。随着分子生物学技术的飞速发展,近年来以基因工程重组表达抗原作为诊断制剂建立的诊断新技术已显示出独特的优越性。张雪寒等[13]把JEV的E基因经过体外昆虫细胞表达,获得抗原性良好的蛋白作为诊断抗原,用其建立的间接ELISA方法能很好地用于猪群JEV抗体水平的检测。

2.4.5 竞争法测抗体 待测抗体与酶标抗体竞争与固相抗原结合,样品中抗体愈多,结合到固相抗原上的酶标抗体就越少,显色就愈浅。步骤为:先用特异抗原包被固相载体并封闭,同时加入待测样本和酶标抗体,孵育一定时间后洗板,加入酶底物,孵育显色测定。显色深为阴性,显色浅或不显色为阳性。

2.4.6 竞争法测抗原 待测抗原与酶标抗原竞争与固相抗体结合,样品中抗原愈多,结合到固相抗体上的酶标抗原就越少,显示就愈浅。步骤为:先用特异抗体包被固相载体并封闭,同时加入待测样本和酶标抗原,孵育一定时间后洗板,加入酶底物,孵育显色测定。显色深为阴性,显色浅或不显色为阳性。

2.5 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术(immunocolloidal gold,ICG)是一种常见的标记技术,自1971年Faulk和Taylon用兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合、制备成金标抗体检测细菌表面抗原的分布,30年来胶体金技术得到不断的发展和成熟,已在免疫诊断领域得到广泛应用,显示出了极大的魅力。目前医学检验中应用的胶体金快速诊断技术主要有两种:胶体金快速免疫层析法(colloidal gold enhanced immunochromatography assay,GICA)和快速斑点免疫金渗滤法(dot-immunogoldfiltrationassay,DIGFA)[14]。这两种方法的基本原理都是以微孔滤膜为载体,包被已知抗原或抗体,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合,再用胶体金结物标记而达到检测目的。

2.6 乳胶凝集试验

乳胶凝集试验(latex agglutination test,LAT)是用免疫无关的载体-聚苯乙烯乳胶将可溶性JEV抗原吸附于载体颗粒表面,该载体颗粒称为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体相遇后,在电解质的作用下抗原与抗体发生特异性结合,载体颗粒也就被动凝集起来,抗体也就以此凝集得到证明。这是一种快速简便的实地检测方法,但灵敏度较低。

2.7 微孔杂交法

微孔杂交法(PCR-ELISA)是使用亲和素包被微孔板,再用生物素标记捕获探针3′端,通过生物素和亲和素的交联作用将捕获探针固定在微孔上,制成固相捕获系统。在扩增时,引物用抗原(生物素、地高辛、荧光素酶等)标记,这样扩增产物中就会带有抗原,用扩增产物与微孔上的捕获探针杂交,靶序列被捕获。再在微孔中加入用辣根过氧化物酶标记的抗体,抗体与靶序列上的抗原结合,再加入底物使之显色,从而实现对病毒的检测。日本脑炎病毒杂交探针仅与本型病毒呈杂交阳性,而与其他各型病毒无明显交叉。徐晓立等[15]研究证明,微孔杂交法能快速检测出JEV。

3 分子生物学诊断方法

3.1 反转录-聚合酶链反应

反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以待检病毒RNA为模板,经逆转录生成 cDNA,再以特异性JEV引物对cDNA进行扩增。经凝胶电泳检测,如果出现目的条带,则该病毒为JEV。吕晓丽等[16]用该法成功检测出JEV阳性样本。

3.2 套式PCR

套式-PCR(RT-nested polymerase chain reaction)是应用两对引物先后扩增靶片段的一种技术,即先应用一对外侧引物进行第一次扩增,再将第一次扩增产物做为模板,用另一对内侧引物对其扩增,从而保证了结果的特异性和敏感性。目前该法已成为日本脑炎的早期快速诊断有力工具。

3.3 半套式RT-PCR

半套式RT-PCR(RT-semi-nested-PCR)是应用三条引物先后扩增靶片段的一种技术,内、外套引物共用一条上游或下游的引物,在保证检测的特异性和灵敏度的情况下,降低了引物设计的难度和成本。RT-semi-nested-PCR对脑脊液样本检测有明显优势。

3.4 实时荧光RT-PCR

实时荧光RT-PCR是在常规PCR的基础上加入荧光标记的核酸探针,PCR后产物无需电泳,能避免假阳性,自动分析处理数据,缩短了检测时间,提高灵敏度和特异性。目前用于JEV检测的实时荧光PCR主要有SYBR Green I实时PCR和Taq-ManPCR[17]。

3.4.1 SYBR Green I实时 PCR SYBR Green是一种只与DNA双链结合的荧光染料,当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号减弱。因此,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。朱兆奎等[18]研究证明,该方法可灵敏、准确检测出JEV。

3.4.2TaqMan PCRTaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶3′→5′外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号,由于探针与模板是特异性结合,因而荧光信号的强弱就代表了模板的数量。刘卫滨等[19]利用TaqMan PCR技术,建立了JEV实时荧光PCR检测方法。

3.5 基因芯片技术

基因芯片(gene chip)也叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray),是近年发展起来的一种新型实用的高新生物技术,已成为目前国际上生命科学研究的热点之一[20]。基因芯片技术是利用核酸杂交原理,在基片上固定大量可寻址的靶基因构成基因芯片,芯片与荧光素标记的样品核酸探针杂交,杂交结果经精密扫描仪扫读和分析,该技术可用于对多种疫病的联合检测[21]。基因芯片技术具有高通量、并行性和微型化的特点,现已广泛应用于人和动物感染性疾病的诊断[22]。张海燕等[23]成功构建了用于日本脑炎病毒与黄热病病毒联合诊断基因芯片。

3.6 核酸探针检测技术

核酸探针技术是利用碱基互补原理来检测目的同源核苷酸片段,具有敏感性高、特异性强的特点。随着分子生物学技术的发展,核酸探针技术被广泛地应用于各领域,如疾病诊断,特别是病毒病的诊断、基因杂交及文库筛选等[24]。该法具有快速、准确、灵敏、操作简单、易于大量制备等优点,缺点是灵敏度较PCR方法低。

4 其他方法

4.1 CT检测法

目前,CT已应用于日本脑炎诊断,黎喜等[25]通过对34例日本脑炎患者进行颅脑CT扫描,共发现异常征象者25例,阳性率为73.5%,证明该法能用于日本脑炎的诊断。

4.2 MRI诊断法

MRI诊断法(magnetic resonance imaging)在揭示丘脑和丘脑外异常表现方面比CT更敏感,丘脑改变对日本脑炎诊断有价值。Kalita J等[26]对21例日本脑炎患者头颅进行CT扫描,有15例表现丘脑的低密度改变,31例日本脑炎病人MRI检查均有异常改变,其中17例CT未发现异常。

5 展望

由于各种技术都有其优点和缺陷性,为了及时、准确的对日本脑炎进行诊断,需要根据具体情况选择合适的诊断方法。在条件允许的情况下,多种方法联合使用,可提高诊断结果的可靠性。随着微生物基因组学、现代分子生物学和免疫学的发展以及新仪器研发、使用,实时荧光PCR仪、基因芯片技术以及JEV单克隆抗体的广泛应用,日本脑炎必将实现快速、准确、灵敏、特异、高通量、自动化检测和诊断,大大提高日本脑炎诊断的准确性和效率,为挽救患者与及时的制定预防措施赢得宝贵的时间。

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Progress on Diagnosis of Japanese Encephalitis

PEI Guo-shun1,FENG Ruo-fei1,2,HOU Lan-xin1

(1.College of Li fe Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou,Gansu,730030,China;
2.Key Laboratory of State Ethnic Af fairs Commission for Bioengineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou,Gansu,730030,China)

Japanese encephalitis is an insect-borne disease harm seriously endangers the pig industry and human health,and causes large economic losses each year.In order to better control and prevention of this disease,timely diagnosis is particularly important.The diagnosis of Japanese encephalitis are virus isolation and identification,serological diagnostic technology and molecular biology technology and so on.each diagnostic technology has its advantages and disadvantages,so the appropriate method of diagnosis should be selected should be selected basing on actual situation.The paper reviewed the principles and characteristics of different diagnosis technology,and prospected the development vision diagnosisof Japanese encephalitis.

Japanese encephalitis;immunofluorescence;diagnosis;PCR;ELISA

S855.99

A

1007-5038(2010)09-0085-05

2010-03-26

裴国顺(1981-),男(苗族),贵州松桃人,硕士研究生,主要从事人兽共患病诊断技术研究。