不同细胞因子在体外诱导耐受性树突状细胞的作用*

钟志宏,鄢 俊,张品俊综述,陈国安审校

(1.赣南医学院教务处,江西赣州341000:2.赣南医学院第一附属医院,江西赣州341000;3.南昌大学第一附属医院,南昌330006)

树突状细胞(dendritic cell,DC)是体内功能最强的专业性抗原呈递细胞,近年来,DC在免疫应答中的双向调节作用引起了移植学者的广泛关注,其中耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cells,tDCs)能够诱导特异性T细胞免疫耐受。由于DC主要分布在肝、心、肾等非淋巴器官,数量极为有限,几乎不可能从新鲜组织大量分离获取,对其研究多依赖体外应用细胞因子诱导扩增。目前发现,骨髓细胞或外周血单核细胞在某些细胞因子调节下可在体外定向诱导生成tDCs,如粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、血管活性肠肽、地塞米松、脂多糖。此外,白细胞介素 10(IL-10)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和阿司匹林(Aspirin)也有助于 tDCs生成。本文就不同细胞因子在体外诱导tDCs的作用进行综述。

1 GM-CSF的作用

GM-CSF属于造血生长因子,对体内肝星状细胞(HSC)分化为DC具有促进作用,同时GM-CSF还能促进体内DC的成熟与活化。GM-CSF是体外扩增tDCs的最重要的细胞因子,常被单独或与其他细胞因子联合使用培养tDCs。有研究结果表明,常规剂量GM-CSF下培养出的DC为成熟DC和未成熟DC(immature dendritic cells,iDC)的混合体,而在极低剂量GM-CSF下可培养出较单纯的iDC。低GM-CSF的环境仅适于某种DC亚型的分裂增殖,这种DC亚型高水平分泌IL-10,抑制了自身的分化成熟。与成熟DC相比,iDC最显著的表型特征是不表达或低表达协同刺激分子,这也被认为是其诱导免疫耐受的主要分子基础。有实验显示:用小鼠的骨髓细胞作DC前体细胞,适合于培养iDC,而利用细胞因子体外诱导iDCs是培养tDCs的基本方法,其中,低剂量GM-CSF被认为是诱导tDCs最重要的细胞因子。

2 血管活性肠肽的作用

血管活性肠肽是由28个氨基酸组成的直链肽,相对分子质量3 323,属胰高血糖素-胰泌素家族,其结构与垂体腺苷酸环化酶活性肽(PACAP)很相似,药理学效应也相似。越来越多的证据表明,血管活性肠肽能下调DCs共刺激分子和加强DCs对T细胞诱导向Th2型偏倚作用,提示血管活性肠肽具有诱导tDCs生成作用[1-2],实验也证明了血管活性肠肽诱导生成的tDCs刺激 T细胞反应能力很弱[3]。Chorny等[4]用经血管活性肠肽诱导的DC(DCVIP)与同种异体反应性CD4+T细胞共培养,结果显示对T细胞的刺激能力非常弱。此外,经DCVIP与CD4+T细胞共同混合培养的CD4+T细胞,再次与同种异体成熟DC共培养也不能扩增[1],提示DCVIP诱导了失能T细胞,或Treg细胞[5]。实验也证明DCVIP诱导生成的T reg细胞具有分泌IL-10、TGF-β的能力,并能抑制同基因型的效应T细胞扩增。表明血管活性肠肽能诱导tDCs,进一步诱导T reg细胞产生[6],从而发挥诱导抗原特异性免疫耐受作用。

3 地塞米松的作用

地塞米松相对分子质量为392.47,是一种人工合成的肾上腺皮质激素,是免疫抑制剂,目前研究认为,地塞米松可影响DC的分化和发育,在器官移植后更好地诱导移植免疫耐受。地塞米松处理过的DC,其协同刺激分子CD86的表达水平降低[7],具有抵抗脂多糖刺激DC成熟的能力(可能意味着 Toll样受体4的表达较低),且其刺激同种异基因T细胞的增殖能力很弱,说明地塞米松可使DC处于稳定不成熟状态,还可使DC协同刺激分子的表达水平降低而成为“耐受原DC”,从而诱导免疫耐受。有实验联合应用血管活性肠肽和地塞米松诱导tDCs效果最佳,推测血管活性肠肽、地塞米松在诱导tDCs方面可能存在协同作用,使DCs共刺激分子表达下调,有利于骨髓单个核细胞定向分化为tDCs。

4 脂多糖的作用

目前大多数学者认为,iDC诱导免疫耐受,成熟DC诱导免疫应答反应[8]。然而iDC具有不稳定性,在各种细菌、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ)等因子的作用下均可迅速发育成熟。脂多糖(LPS)是含糖和脂质的化合物,在组成上糖的分量多于脂,故名。有实验采用血管活性肠肽、地塞米松与GM-CSF等细胞因子诱导小鼠骨髓单个核细胞生成tDCs,在进一步加入LPS诱导成熟后仍保持免疫耐受特性[9],低表达共刺激分子(CD40,CD80和CD86),低分泌IL-12而高分泌IL-10[10],刺激T细胞向 Treg细胞分化增殖[11]。推测iDC可能存在不同亚型的DC,tDCs和免疫性DC,其分别调节机体免疫平衡。有实验认为小鼠骨髓细胞经低剂量GM-CSF体外诱导可分化为iDC,经LPS刺激后,DC表达CD40呈现部分激活状态,IL-10明显升高,使IL-10/IL-12上升,一方面抑制了DC分化成熟,另一方面这种自分泌Th2细胞因子充当抗原提呈第3信号,更有利于T淋巴细胞失能和诱导耐受型T辅助细胞,拥有更强的致耐受性。

5 IL--10的作用

IL-10是一种多效性细胞因子,可作用于不同免疫细胞,作用复杂兼有免疫刺激和免疫抑制效应。IL-10可调节髓系细胞的细胞因子、可溶性介质的分泌和细胞表面分子的表达,影响其参与免疫、炎症反应的能力[12]。IL-10系抑制单核细胞分化为DCs的主要因子,能强烈阻断多种因子刺激DC成熟,如IL-10可抑制人血中单核细胞在含GM-CSF和IL-4培养条件下产生iDC,亦抑制内毒素、CD40L或TNF-α对iDC的活化成熟作用。在缺乏GM-CSF和IL-4时,IL-10诱导单核细胞分化成巨噬细胞样细胞。对新鲜分离或培养的浆细胞系DC,IL-10可诱导其凋亡。IL-10对小鼠骨髓来源的髓系DC的作用与人有所不同,一方面抑制其成熟使MHC分子表达低下,另一方面则上调共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达,说明小鼠在IL-10存在下诱导产生了不完全成熟的髓系DC,后者缺乏活化T细胞的能力。DC在发挥免疫作用时会分泌IL-12,IL-10可抑制各型DC产生IL-12和表达共刺激分子,因此削弱了DCs刺激Th1细胞反应的能力。有资料证实,IL-10可明显阻止吞噬细胞(如DC)中IL-12p40的基因转录过程,因而下调DC中IL-12的表达,减少IL-12的分泌,进而减弱DC的抗原呈递功能[13]。这或许从分子水平解释了IL-10对DC的抑制作用。IL-10处理过的DCs不仅能削弱T细胞反应的能力,而且可介导抗原特异耐受状态。同时,IL-10还能够抑制过敏反应和自身免疫反应,诱导肿瘤逃避免疫监视。

IL-10是体内抑制性细胞因子,可下调DCs表面M HC-Ⅱ类分子、共刺激分子、黏附分子及成熟DCs特异性标志CD83的表达。IL-10能诱导Th0向Th2反应偏倚,并抑制IL-12合成。IL-10还可促进单核细胞来源的DC诱导抗原特异性CD4+和CD8+T细胞免疫无能,表现为T细胞增殖减弱,IL-2、IFN-γ分泌降低。此类DC主要对抗成熟信号,可抑制T细胞免疫应答,诱导T细胞耐受或产生 Treg细胞[14]。

6 TGF-β的作用

TGF-β是属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族。近年积累的大量实验证据表明,机体可能更主要地通过CD4+、CD25+调节性 T细胞以“主动”的方式维持自身免疫耐受。CD4+、CD25+T细胞是机体中主要的调节性T细胞,在体内发挥免疫调节功能。CD4+、CD25+T细胞能分泌TGF-β和IL-10[15],这两种细胞因子都能抑制DCs的成熟,因而它能诱导tDCs的产生。有研究用骨髓来源DC与CD4+、CD25+T细胞共培养,发现DCs能刺激 CD4+、CD25+T细胞活化增殖,这种刺激作用需通过细胞间的相互接触来实现,增殖后的CD4+、CD25+T细胞仍保持原有的抑制作用,这为DCs调节自身免疫和其它免疫反应提供了一种新的作用机制。有研究发现,TGF-β诱导后DC表面抗原CD40,CD80,CD86及MHC-Ⅱ类分子的表达都有明显下降[16],并明显抑制了混合淋巴细胞反应(MLR)中同种异体T细胞增殖,说明TGF-β能够通过下调DC表面协同刺激分子的表达,降低DC成熟状态,抑制T细胞活化、增殖,进一步抑制DC诱导免疫反应的能力。另有学者研究认为TGF-β可促使DC维持在不成熟状态,这种iDC可以诱导T淋巴细胞的低应答,在诱导移植免疫耐受中发挥着重要作用。

此外,TGF-β在伤口愈合和组织修复中具有重要作用。TGF-β需经蛋白水解或伤口中的酸性环境激活。在受伤和炎症发生后,渗出的细胞成为TGF-β的主要来源。产生和释放的TGF-β刺激成纤维细胞合成胶原和其他细胞外基质并抑制胶原蛋白的降解,趋化成纤维细胞和巨噬细胞。这些作用与组织的修复相关,在某些条件下可以恢复组织的正常结构,并可能导致组织纤维化。

7 阿司匹林的作用

目前认为tDCs诱导免疫耐受的机制主要为低水平表达MHC-Ⅱ类分子,不表达或低水平表达共刺激分子(CD80、CD86)和CD40。由于在T细胞激活过程中缺少了免疫应答所必需的第二信号,T细胞不能被活化增殖,体外刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱。相反tDCs可诱导抗原特异性T细胞无能或凋亡,从而诱导抗原特异性耐受。而常规DCs在LPS的刺激下发育成熟,能为T细胞活化提供所必需的表面分子,因此刺激T细胞增殖的能力较强。阿司匹林是乙酰水杨酸类药,广泛用于解热镇痛、消炎、抗风湿、抗血小板聚集等处,是临床上最常用的药物之一。有研究发现阿司匹林-处理的DCs低水平的表达CD40、CD80、CD83和 CD86,对免疫刺激呈耐受性[17]。有研究观察到阿司匹林不影响骨髓单个核细胞向DC分化,对DC活力亦无显著影响;但可明显抑制DC表面的CD86、CD80共刺激分子表达,从而诱导T淋巴细胞无能,且其促进T淋巴细胞增殖能力明显减弱,说明阿司匹林有免疫抑制功能。

DC的发育、成熟和生物学功能表达的过程有其时序性,存在正反馈和负反馈,有DC自身的反馈,也有其他细胞的影响,如T细胞、NK细胞,甚至上皮细胞。体内和体外实验都证明,DCs通过与NK细胞接触而形成免疫突触,借助分泌的细胞因子,促进了NK细胞的活化增殖并增强其细胞毒性,提高了NK细胞清除病原微生物的能力。激活的NK细胞也能够诱导DCs的成熟并选择性杀伤iDCs。NK细胞分泌的IFN-γ又可有效地启动和调节Th1应答和特异性T淋巴细胞(CTL)反应。因此,NK细胞和DCs相互作用是一个正反馈过程。更令人兴奋的是,有研究发现tDCs能刺激初始T细胞转化成调节性T细胞,反过来,CD4+、CD25+T细胞也能促进 DC前体细胞分化为具有耐受性的DCs。这样 tDCs与Treg细胞[18]之间形成了一个抑制性的反馈,在诱导和维持免疫耐受中起重要作用。这说明DCs与CD4+、CD25+T细胞在诱导免疫耐受中是相互促进,相辅相成的。

目前已发现多种细胞因子参与tDCs的体外诱导增殖过程,但目前对tDCs的研究多局限于体外实验,在复杂的体内环境中,其分化途径和影响功能的因素都不十分肯定,很可能是多种因素综合作用的结果,而且存在复杂的调控机制。例如:体内单核细胞、肥大细胞、T调节细胞和肿瘤细胞等多种细胞均分泌IL-10。在IL-10的刺激下,DC诱导Th细胞向Th2细胞分化,后者再分泌 IL-10,作用于 DC,形成正反馈效应,进而抑制免疫反应;体内单核细胞、B淋巴细胞及其他辅助细胞可产生IL-12,它可增加许多效应细胞包括T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞的溶细胞作用,诱导细胞因子如IFN-γ的产生,刺激Th1细胞的形成。因此,tDCs体内诱导免疫耐受的影响因素还有待进一步研究,为tDCs在预防移植免疫排斥反应和治疗某些自身免疫性疾病的临床应用提供实验依据[19]。

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