膜联蛋白A5的结构与功能研究进展

王小杰，李 欣，武彦秋，李晓通，柳娇娇，张 波

(1.承德医学院基础医学研究所，河北承德 067000;2.承德医学院附属医院儿科; 3.承德医学院临床医学系2009级）

综述讲座

膜联蛋白A5的结构与功能研究进展

王小杰1，李 欣1，武彦秋2，李晓通3，柳娇娇3，张 波3

(1.承德医学院基础医学研究所，河北承德 067000;2.承德医学院附属医院儿科; 3.承德医学院临床医学系2009级）

膜联蛋白;A5;结构;功能;研究进展

膜联蛋白(Annexin,ANX）是一个Ca2＋依赖的磷脂结合蛋白家族，在脊椎动物，ANX家族目前已发现有12个成员(ANXA1－A12，A13）。它们不同于其它的Ca2＋结合蛋白，如EF-hand家族等。ANX具有可锚定到细胞膜上的独特结构，且这种锚定是可逆的。每个ANX都由两个区域构成:(1）C末端:即核心区域，是由70-80个氨基酸构成的4个(ANXA6有8个）重复序列，排列成5个α螺旋(分别称为A、B、C、D、E），并形成一个紧凑的、稍有凹凸的盘状。在这个盘状的突出面即α螺旋上，具有Ca2＋与膜的结合位点。此核心区域高度保守。(2）N末端:在每个ANX的N末端，氨基酸排列顺序及长度各不相同，从而形成了每个ANX不同于其它ANX的自身的特点。也正是由ANX N端的氨基酸介导了与蛋白配体之间的相互作用，并调节ANX-膜的关系。

ANX功能多样，如参与细胞膜的组成、胞吐、胞吞、离子通道调节、离子通道活性、细胞信号转导及细胞膜与细胞骨架的连接等[1]。其中除ANXA5外，其它ANX均可作为一些酶类如磷脂酶A2(APL2）和蛋白激酶C(PKC）的底物，而使其磷酸化。而ANXA5却由于其缺乏PKC的结合位点而不能成为其底物。相反，却可在Ca2＋存在下与PKC竞争结合磷脂而导致ANXA5抑制PKC的活性。ANXA5的结构基本已经弄清，但其还有许多功能有待于继续研究。下面就ANXA5的结构特点和已知的功能作一综述。

1 ANXA5的结构

ANXA5是ANX家族中最多、分布最广的ANX。它最初是在1970年发现于人的胎盘[2]，其基因位于染色体4q26-q28上，有13个外显子，12个内含子。其cDNA由320个氨基酸构成，分子量为35935Da[3]。X-射线结晶学[4]和低温电镜[5]研究表明，ANXA5有可溶型和膜结合型两种存在方式。单体ANXA5有4个重复区域并排列成对，呈突出的圆盘形，在每个凸面上都有与磷脂和Ca2＋的结合位点。其立体构型非常典型，包含两种类型:Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅱ型即AB型，即在AB环上的Ca2＋的结合位点，其结合力最高;Ⅲ型即在N末端有B螺旋(B位点）和D螺旋(D位点），其与Ca2＋的结合力不高。

2 ANXA5的功能

2.1 ANXA5与细胞凋亡 凋亡是一种普遍存在的细胞死亡形式。对凋亡的检测有多种，最早是以HE染色来对凋亡进行描述[6]:细胞核皱缩，核膜溶解，染色体边集，DNA断裂，膜包小泡出胞，最后形成凋亡小体而被周围的细胞或吞噬细胞所吞噬。检测细胞凋亡最常见的就是TUNEL和DNA Ladder。其它方法如用免疫印迹、共聚焦显微镜等检测caspase-3的活性亦可行。然而，所有这些方法都需要获得组织，因此，对细胞凋亡的检测属于体外检测，无法在活体组织内应用。而体内细胞凋亡的检测是非侵入性的，而且检测到的是细胞的早期凋亡。在细胞凋亡早期，最为突出的特征就是磷脂酰丝氨酸(phosphatidyserine,PS）的外翻。PS大量外翻，似乎是一面写有“来吃掉我”的醒目的旗子[7]，周围的吞噬细胞接受到某种信息而向其游动，最终将其吞噬清除。而ANXA5在Ca2＋存在的条件下，与PS有极高的结合力(kd≈0.5-7nM）[8]。这种结合力强，且十分快速。同时，又由于ANXA5形成的二维空间构型(2D构型）与PS结合后，阻碍了吞噬细胞对凋亡细胞的识别和结合，从而使凋亡进程受到抑制。

ANXA5在胞外除可与PS结合而起到对凋亡细胞的示踪作用外，似乎对凋亡的过程也发生了一定影响。但细胞内的内源性ANXA5对细胞的功能有什么作用，目前还不清楚。Hawkins等[9]采用基因敲除法，使B淋巴细胞不表达ANXA5，发现缺失ANXA5的B细胞对一系列凋亡诱导剂不发生反应，即缺失ANXA5的B淋巴细胞无法发生Ca2＋依赖的细胞凋亡。Wang等[10]报道,抑制ANXA5介导的Ca2＋内流，使软骨细胞凋亡减少。Monceau等[11]研究发现，内源性ANXA5的外翻参与了大鼠心肌细胞的凋亡。他们证实，若在线粒体激活前洗去外翻至膜外的ANXA5，或用抗ANXA5抗体除去ANXA5，则可降低细胞凋亡。这些研究似乎都表明内源性ANXA5对细胞凋亡有促进作用。

2.2 ANXA5与Ca2＋通道 ANXA5是一种离子通道，可使Ca2＋内流。电生理学研究表明，ANXA5的离子通道活性与富含ANXA5的基质小泡与磷脂结合后产生的离子通道效应非常相似[12]。而若ANXA5降解或突变缺失了N末端，则Ca2＋内流现象消失[13]。Zn2＋是这种Ca2＋通道的阻滞剂[12]。ANXA5也可介导Ca2＋内流入酯脂体中，抗ANXA5抗体和Zn2＋都可抑制此反应，这些说明，在体外，ANXA5构成了Ca2＋通道;ANXA5也可介导Ca2＋内流入淋巴B细胞，缺失了ANXA5的B淋巴细胞无法产生过氧化氢诱导的Ca2＋内流。总之，这些研究表明，ANXA5在体内也发挥了Ca2＋通道作用。

2.3 ANXA5与凝血 凝血过程始发于组织因子(tissue factor,TF）暴露于血流，TF与相邻的磷脂结合后与凝血因子Ⅶ结合，使Ⅶ因子激活为Ⅶa。TF-Ⅶa复合物又相继激活Ⅹ因子和Ⅺ因子，这些复合物的形成需要磷脂的存在，尤其是PS[14]。当血小板激活后，其PS从细胞膜内面翻至细胞膜外面，ANXA5蛋白聚集于血小板外翻的PS上，排列成二维空间构型(2D)，从而遮蔽了PS，使磷脂依赖的凝血因子无法与磷脂结合而激发凝血反应[15]。同时，由于ANXA5与PS结合后使细胞膜出现了一个新的入膜通道，ANXA5与PS结合物及其周边的TF从新通道进入细胞质中，使得TF在细胞膜表面的表达下调[16]。

由于抗磷脂蛋白抗体和ANXA5均可与PS结合，故抗磷脂抗体可抑制ANXA5与PS结合,从而减弱ANXA5的抗凝作用[17]。临床上的抗磷脂综合征正是与ANXA5抗凝血相关的一种疾病。抗磷脂抗体可破坏ANXA5与细胞膜上磷脂结合后形成的2D空间构型，使细胞膜上的磷脂暴露，从而引发凝血反应，并降低ANXA5的抗凝血作用[18]。

2.4 ANXA5与骨 在骨的构建过程中，机械环境有着非常重要的作用。研究发现，多种机械作用都对骨细胞的代谢产生影响，如直接使细胞变形[19]、液流造成的切应力[20]及生物电场[21]。骨细胞对这些刺激会发生多种反应。像切应力会使许多胞内外的信使发生改变，表明骨细胞对其所处的机械环境非常敏感，但这些信号如何转导入细胞,从而使细胞发生反应还不清楚。因此，有人提出了“机械信号受体”一说，即此受体可根据细胞外环境机械力的改变而使细胞膜上的离子通道或开或关。这种通道存在于多种细胞包括骨细胞内[22，23]。有人认为，ANXA5可能就是一种机械信号受体，或是一种机械敏感型通道[24,25]，因为体外实验观察到，ANXA5可与胶原蛋白结合[26]，从而可感受到细胞外基质的变化。ANXA5作为细胞内的一种蛋白，又可经过某种方式分泌至胞外，说明ANXA5可能是一种穿膜蛋白。有研究表明，ANXA5可形成一种穿膜复合体[27]，而ANXA5也发现存在于鸡的成骨细胞上[26]。ANXA5也可与细胞骨架结合，如可与人血小板的肌动蛋白相互作用而形成复合体，且它可被抗肌动蛋白抗体识别[28]。近来有研究表明，ANXA5可与β整合素的亚单位结合[29]。这些ANXA5与细胞骨架结合的证据表明，ANXA5形成穿膜复合体后，其作用相当于一个机械敏感装置。另外，Ca2+浓度的改变，可使ANXA5在细胞内的分布部位发生改变。在骨细胞中，ATP可使ANXA5移向胞膜和核膜。

ANXA5在软骨内成骨过程中发挥着极其重要的作用[30]。通过与细胞外基质的胶原蛋白Ⅱ和Ⅹ相互作用，ANXA5可介导Ca2+内流入基质小泡中，而此基质小泡正是生长旺盛的软骨细胞所分泌。ANXA5介导的Ca2+流入基质小泡后就起动了软骨细胞的骨化[31]。在胚胎形成期，ANXA5主要存在于骨骼系统[32]。在胚胎形成初期(9.5-12.5天胚胎），ANXA5的表达主要在血管构筑系统;而在后期阶段(>13.5天），ANXA5在软骨表面有大量表达，如在中轴骨骼、肋骨、肢芽等。在成熟大鼠，ANXA5主要存在于软骨组织和骨骼。这些都表明，ANXA5在骨骼的生长发育过程中起着至关重要的作用。

2.5 ANXA5与肿瘤 目前，关于ANXA5与肿瘤的关系研究还比较少,仅有日本一家实验室报道[33],宫颈癌和子宫内膜癌内，ANXA5的表达比正常组织减少。Dooley等[34]报道，在皮肤癌中，ANXA5在mRNA水平上是增高的。但这些研究仅仅是一种观察性研究，并未对可能的机制进行研究。既然在肿瘤组织中，ANXA5的表达发生了改变，就说明ANXA5与肿瘤的发生有着密切的联系。究竟ANXA5的表达改变是肿瘤发生过程中的“因”还是“果”，现在尚未得知。因此，可以说，ANXA5与肿瘤的发生二者之间的关系研究及发生机制还有很长的路要走。

总之，ANXA5功能多样，但还有许多功能目前还未清楚，尤其是与肿瘤的关系研究。

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