Duchenne型肌营养不良症的干细胞治疗

孙默萱，孙文长

(大连医科大学 微生物学教研室，辽宁 大连 116044)

Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是中国最常见的X连锁隐性遗传肌病，发病率约3/10万活男婴，女性为致病基因的携带者，所生男孩50%发病。临床特征主要为缓慢进行性加重的对称性肌肉无力和萎缩，无感觉障碍。通常3～5岁隐性起病，大多数患者伴有心肌损害，约30%患儿有不同程度的智能障碍。患儿一般12岁起不能行走，需坐轮椅，晚期患者因呼吸肌萎缩，多数在20多岁因呼吸道感染，心力衰竭而死亡[1]。

DMD的基因位于染色体Xp21，该基因跨度2300 kb，是已发现的人类最大基因，cDNA长14 kb，编码3685个氨基酸，组成427 kD的抗肌萎缩蛋白。该细胞骨架蛋白位于骨骼肌和心肌细胞的质膜面，具有细胞支架、抗牵拉、防止肌细胞膜在收缩活动时撕裂的功能。DMD患者因基因缺陷而使肌细胞内缺乏抗肌萎缩蛋白，造成肌细胞膜不稳定并导致肌细胞坏死和功能缺失[1]。

目前,没有有效措施来防止DMD症状出现或阻止病情恶化。针对DMD主要采取对症治疗及支持疗法，如增加营养，使用ATP及维生素E等。多年来，人们一直在努力探索，寻找根治的有效方法。

1 干细胞的概要

干细胞(stem cell)是通过细胞分裂可以自我更新、并能分化产生特定细胞的细胞。胚胎干细胞分化潜能较大，在一定条件下可分化为机体任何一种组织器官，而成体干细胞分化潜能较小，其存在于成熟个体各种组织器官中，通常只能分化为相应的组织细胞，如肌肉干细胞。不同类型的干细胞已被用于肌肉萎缩动物模型(mdx小鼠)中，以合成抗肌萎缩蛋白，修复部分病理组织[2,3]。

2 干细胞治疗

2.1 肌肉卫星细胞

肌肉“卫星细胞”位于骨骼肌纤维基板下，紧邻浆膜，其中的前体细胞参与肌肉的生长和修复。具有以下表面标记的(CD45-Sca-1-Mac-1-CXCR4+β1-integrin+，CSM4B)的骨骼肌前体细胞可以分化为肌肉细胞，而mdx小鼠的此种骨骼肌细胞前体数目减少。从卫星细胞池中纯化了CSM4B骨骼肌细胞前体，植入抗肌萎缩蛋白缺如的mdx小鼠，这些细胞前体可以分化成肌纤维，使抗肌萎缩蛋白表达，降低了肌肉炎症和纤维化，明显提高了收缩功能。移植的骨骼肌细胞前体也进入卫星细胞区，更新了内源性干细胞池并加入随后的损伤修复中。有一些卫星细胞不仅具有分化功能，同时能进行自我更新[4]，具有骨骼肌干细胞功能，因此骨骼肌能终身执行修复功能并且始终保持卫星细胞池稳定。此种干细胞对其他肌肉的损伤也有良好的治疗前景。

在肌肉生长的不同时期，细胞表面标志物也各不相同。Pax基因是肌肉生长的关键性调节因子，Pax3和Pax7决定早期肌肉形成，Pax3的持续表达是生成骨骼肌细胞前体的关键步骤[5]，在转录因子Eya2、Six1和Dach2的协助下激活Myf5使其表达[6]。肌源性调节因子Myf5、Myf6、MyoD和肌细胞生长素等是一系列调节肌肉生成的基础，Myf5、Myf6、MyoD对骨骼肌的发育尤其重要，三者均突变的胚胎完全没有成肌细胞和骨骼肌纤维，对突变物种的进一步遗传分析发现，在调控骨骼肌发育过程中，Myf5和Myf6是MyoD的上游调节因子[7]。研究证实，将卫星细胞在体外培养使其分化能力降低[8]，对疾病的治疗不利。因此，在选择并分离合适的骨骼肌干细胞时应选择高分化潜能的Pax3/7++细胞。

2.2 成血管细胞

目前，实验多采用小鼠为研究对象，但小鼠并不能展现出此种疾病的全部临床特征。为了进一步向临床应用，必须论证干细胞移植在大型肌肉萎缩动物模型中的有效性。GRMD(Golden retriever muscular dystrophy)狗严重缺乏抗肌萎缩蛋白，不仅影响肢体、呼吸肌和心肌功能，而且累及咽肌，使消化功能严重受损[9]。当与 C2C12小鼠的肌母细胞同时培养或转染 MyoD时，狗的外源性野生型成血管细胞(mesoangioblast)分化形成了多核肌管。为了检测干细胞治疗或基因疗法的有效性，在不同程度免疫抑制下，研究者将自身抗肌萎缩蛋白基因更正的成血管细胞和外源性野生型成血管细胞分别植入两个GRMD狗试验组，并设立对照组。实验结果分析显示，外源性野生型成血管细胞使得受试对象大量表达抗肌萎缩蛋白，肌纤维得以重建，肌肉收缩功能明显增强，甚至能恢复正常的行走功能。而经过基因更正的成血管细胞输回自体产生的治疗效果相对较差[7]。在使用外源性野生型成血管细胞治疗的实验组中，66.7%受试对象表现出明显的功能增强。实验结果失败的2只狗，其中1只死于突发的心脏病，另一只由于注射的外源性野生型成血管细胞的量过少。而功能增强的4只狗中，有2只直到实验结束都始终保持着良好的运动功能，而另外2只在一段时间后便失去了行走功能。对于这种现象还不能给出明确的解释，不同受试对象间存在的很大变异性，也许与在接受移植细胞后机体的免疫抑制程度不同有关。这些推断直接关系到将来的临床试验，作者建议临床患者使用的供体细胞应来源于HLA配型一致的捐赠者[7]。

2.3 干细胞与基因治疗相结合

已有数据表明，表达CD133表面标志物的人类血液源性细胞前体，能分化形成肌纤维。提取表达CD133的人类肌营养不良血液源性和肌肉源性干细胞，采用外显子跳跃技术纠正原有的基因缺陷，可以产生有功能的抗肌萎缩蛋白，是一种将基因治疗与干细胞治疗相结合的疗法[10]。先分离DMD CD133+细胞并感染慢病毒载体，该载体携带用以剔除外显子51的反义寡核苷酸，可在前体细胞中表达短一些但仍有功能的人类抗肌萎缩蛋白。有肌肉再生潜能的血液源性CD133+干细胞已在前面的工作中被证实，此次展示了肌肉源性CD133+干细胞也有向肌肉和内皮细胞分化的能力。剔除外显子51可以纠正原始阅读框架移位，在外显子48和52之间表达正确的阅读框。剔除后的血液源性和肌肉源性干细胞能在体内融入肌纤维，不仅表达功能性人类抗肌萎缩蛋白，而且质膜再表达α和β肌糖蛋白证实了抗肌萎缩蛋白相关的蛋白复合体得以重建，它们可以分化成为肌营养不良骨骼肌细胞内的卫星细胞。然而，在肌营养不良患者的肌肉内注射这些干细胞只能使周围部分肌纤维得以再生，为了解决这个问题，研究者尝试着在血管内注射干细胞。实验结果显示，大部分受损肌肉不仅在形态上得以纠正，功能也达到了正常水平。此种方法使用患者自身的干细胞，减少了移植的免疫排斥反应。外显子跳跃技术不仅用于骨骼肌纠正原有的基因缺陷，同样也成功地应用于纠正mdx小鼠的心肌基因缺陷，取得了良好的效果[11]。另有研究显示，将含小型化抗肌萎缩蛋白的慢病毒导入新生mdx小鼠，蛋白表达可长达2年，受转化的肌肉干细胞可参与肌肉的再生[12]。但将细胞疗法与基因疗法相结合，也带来了其它问题，尤其是生物安全性问题，可长期表达的逆转录病毒在细胞染色体的整合干扰了机体对一些持家基因、癌基因或肿瘤抑制基因的控制，可能增加肿瘤形成的风险，对此需谨慎考虑。因此，人们又尝试了电转移抗肌萎缩蛋白质粒DNA至肌肉细胞，以避免逆转录病毒整合至宿主染色体的危险[13]。

2.4 诱导多能干细胞与人工染色体

干细胞治疗中的一个难题是移植细胞的免疫排斥问题。最近，诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell)的出现，给这个问题的解决带来了新的手段。将患者的成纤维细胞分离，导入Klf4,Sox2,Oct4,c-Myc 等因子，使之成为患者特异的诱导多能干细胞，再诱导分化成所需要的组织细胞，移植入患者体内，这样可有效地避免移植物的免疫排斥问题[14-16]。研究人员已利用患者的成纤维细胞先导入含DMD基因组的人工染色体，纠正其基因缺欠，再将已纠正的成纤维细胞制备成诱导多能干细胞，最后分化成表达抗肌萎缩蛋白的肌肉干细胞[17]。从干细胞批量诱导形成肌肉细胞的方法也已经建立[18,19]。结果显示，人工染色体表达稳定，相对于慢病毒，无插入突变的危险[20]，患者特异的诱导多能干细胞又可避免移植细胞的免疫排斥问题，因此，这种途径在临床上将有较好的应用前景。

3 展 望

具有自我更新、自我分化能力的干细胞在Duchenne型肌营养不良症的动物实验中取得了预期的良好结果。但考虑到从动物实验到人体应用的复杂性及一系列体内环境因素的影响，在其成为临床治疗方案之前仍需要积极探索，不断完善。干细胞疗法与基因治疗的结合有望在临床治疗中取得良好效果。

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