乳酸在控制猪感染沙门氏菌中的研究

刘国祥 王文庆 申介健 赵 港

乳酸在控制猪感染沙门氏菌中的研究

刘国祥 王文庆 申介健 赵 港

耐药性沙门氏菌越来越普遍，因此，有必要寻找替代方法来控制猪沙门氏菌感染。试验初步研究了乳酸在控制猪沙门氏菌感染的效果。在实验中每头猪接种5 ml 5.6×107CFU/ml(hi)或5 ml 5.6×105CFU/ml(lo)鼠伤寒沙门氏菌(ST)，重现猪临床和亚临床感染。分别喂食加入2.8%乳酸（LA）和不加乳酸（C）的饲料，以观察喂食乳酸的效果。将20只22日龄的猪分成4组，分别为LA-hiST、C-hiST、LA-loST和C-loST，相应的组别喂食相应的饲料。接种ST116后，观察猪的临床症状和检测其粪便中ST116的数量。LA-hiST组没有明显的临床症状，比如腹泻和发热等症状，但是C-hiST组有明显的临床症状，并且猪粪便中沙门氏菌数LA-hiST组低于C-hiST组，LA-loST组低于C-loST组。实验数据表明，饲料中加入2.8%的乳酸能有效的控制沙门氏菌临床和亚临床感染。

耐药性；乳酸；沙门氏菌。

沙门氏菌是一种致病菌，但是在日常生活中，人和动物感染沙门氏菌是非常普遍的。为了降低人类因食入性感染沙门氏菌的风险，从养猪场到屠宰场，都应该采取一些措施，以控制沙门氏菌的感染。

通常用抗生素控制猪感染沙门氏菌，但是，人和动物经常使用抗生素，耐药的细菌就会出现[1]。大量的数据显示，耐药的沙门氏菌来源于人和动物[2,7]。研究人员正在探索控制猪沙门氏菌感染的方法[2]。

继欧盟禁止在食品和饲料中使用大多数抗生素后，出现了一些替代措施，以控制肠道内有害的细菌数量和活性。这些措施包括更严格的管理和使用卫生的产品，比如益生菌、益生素、蛋白酶、中草药、植物提取物、发酵饲料和有机酸等。

乳酸是有机酸，现实中已经被证实，在饲料中添加2.8%乳酸，大大降低了猪粪便中沙门氏菌的数量，从而降低沙门氏菌在猪群中大范围感染的几率。如在日本的一个养猪场，沙门氏菌感染导致猪群出现临床和亚临床症状[3,4]，在喂食添加乳酸的饲料后，沙门氏菌感染得到有效控制。但在实验中，乳酸还没被证实能有效控制沙门氏菌感染。

本论文的目的是评估猪在摄入2.8%乳酸的情况下，控制猪感染沙门氏菌的临床效果，以及在因感染沙门氏菌而有临床和亚临床症状的猪中，降低猪粪便中沙门氏菌数量的效果。猪粪便中沙门氏菌的数量是沙门氏菌能否在猪群中流行的一个重要指标。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

实验用的猪由郸城宏盛养猪场提供，乳酸由河南金丹乳酸科技有限公司提供，对利福平抗生素有耐药性的鼠伤寒沙门氏菌116菌株（简称为ST116）由郑州大学生物系提供，其它实验仪器及材料由河南金丹乳酸科技有限公司技术部和检测中心提供。

1.2 实验方案

确认实验组中每头猪都没感染ST，然后将20只21日龄的猪按性别、体重等条件均衡分成4组，依次为LA-hiST、C-hiST、LA-loST和C-loST，并分别圈养于独立的圈舍内。LA-hiST和LA-loST组喂食加入2.8%金丹牌乳酸的饲料，C-hiST和C-loST组喂食不加乳酸的饲料，直到实验结束。到31日龄大时，LA-hiST和 C-hiST 组接种 5m l 5.6×107CFU/ml的ST116，LA-loST和 C-loST组接种 5 ml 5.6×105CFU/ml的ST116。接种前5 h和接种后1 h内禁止喂食。在接种后第21 d，将实验组猪注射戊巴比妥钠（25mg/kg），使其深度麻醉，然后放血致死。除了接种前后禁食6 h，实验期间的其它时间，实验组猪可以任意摄取饲料和水。

1.3 菌株和接种

ST116最初是从猪身上分离出来的，在实验室中，此菌株能在含有利福平浓度为100μg/ml的DHL培养基上生长。使用前，此菌株保存于-80℃度冰箱中。将此菌株的一个菌落接种于SCD肉汤培液中，于37℃，180 r/min培养箱中培养14 h。然后取20ml接种到180ml SCD肉汤培养液中，于37℃，180 r/min培养箱中继续培养5 h。将此培养液用无菌PBS缓冲液稀释成菌体浓度为107和105CFU/ml，然后分别加入等体积的20%脱脂牛奶。用注射器和塑料管经咽部给予相应组别的猪接种相应的10ml上述菌液。因为含有20%的脱脂奶粉，所以猪会自愿吞咽的。

1.4 临床观察

在接种 ST116 后的第 1、2、3、6、7、9、12、16 和 21 d，收集每组猪的粪便，并且将粪便分成三个等级，0表示粪便正常，1表示粪便稀松，2表示腹泻。从接种ST116前第7 d开始测量猪的直肠温度，直到实验结束。

1.5 细菌学检验

从每组实验猪中收集粪便样品，每克粪便样品用无菌PBS缓冲液稀释成不同的浓度，涂布于显色平板上。将平板置于37℃下孵育24 h，直接计算琼脂平板上的菌落数。然后开始富集和随后的二次富集程序，简单的来说就是：将1 g猪粪便样品溶于10ml无菌PBS缓冲液中，取此溶液1ml溶于9ml营养肉汤培养基中,于41.5℃下培养24 h，或者于室温下放置7 d进行二次富集，分别在显色琼脂平板上划线培养。富集培养中，一旦出现阳性结果，立即终止富集培养程序。尸体解剖中，无菌条件下收集小肠和盲肠内含物，做上述培养，以确定有无ST116及其数量。并且，在无菌条件下收集肝、肺脾、肾、扁桃体和肠系膜淋巴结等组织，做上述培养，以确定有无ST116及其数量。

1.6 统计

正态分布变量，如直肠温度和ST116数量，进行T检验；非正态变量，如粪便评分条件，进行U检验。ST116数量以对数表示，0代表每克猪粪便中有一个ST116。

2 结果与分析

2.1 接种ST116后的临床症状

接种ST116后，整个实验期间，LA-hiST组既未粪便稀松也没腹泻。而在C-hiST组中，80%的猪在接种后的第3、6、7 d出现粪便稀松或腹泻，粪便平均得分分别为 0.8、1.6 和 0.8（见表 1）。LA-loST 组第 3～9 d出现零星稀松粪便和腹泻，C-loST组在第7～9 d出现零星稀松粪便和腹泻，LA-loST和C-loST组粪便最高平均得分分别为0.4和0.6。

表1 接种后各实验组粪便的平均得分

2.2 发热反应

在接种ST116前第7 d开始测量记录每头猪的体温。在饲料中加入2.8%乳酸的（LA-hiST和LA-loST）组，在接种ST116后未观察到有发热反应（见图1）；在饲料中未加入乳酸的C-hiST组，在接种ST116后的第2～9 d有发热反应；C-loST在接种ST116后的第5～8 d有发热反应。

2.3 粪便中ST116的数量

取接种ST116后第3、12、16 d的粪便做实验，发现每克粪便中ST116的数量，LA-hiST组要明显少于C-hiST 组（P＜0.05）（见图 2A）；取接种 ST116后第 6、7、9、12 d的粪便做实验，发现每克粪便中ST116的数量，LA-loST组要明显少于C-loST组（P＜0.05）（见图2B）。通过实验得到LA-hiST、C-hiST、LA-loST和C-loST组中ST116的峰值数量分别是3.2×101CFU/g、1.3×105CFU/g、2.5 CFU/g和 1.3×104CFU/g。

2.4 各器官和肠道内含物的ST116数量情况（见表2）

从尸体回收的肝脏、扁桃体、肠系膜淋巴结等组织以及小肠和盲肠内容物，在无菌条件下恢复培养ST116。LA-hiST、C-hiST、LA-loST 和 C-loST 组小肠中取出的内容物，能培养出ST116的几率分别是20%、80%、40%和 80%；LA-hiST、C-hiST、LA-loST和C-loST组盲肠中取出的内容物，能培养出ST116的几率分别是80%、100%、40%和80%。从对比结果中可以看出，在饲料中添加乳酸的实验组要比没有添加乳酸的实验组，培养出ST116的几率低。并且，在饲料中添加乳酸的实验组要比没有添加乳酸的实验组，含有ST116的数量低。从结果中可以看出，LA-hiST和C-hiST具有统计学上的差异性（P＜0.05）。

表2 每头猪各器官及小肠和盲肠内容物的含菌量

3 讨论

在我们的实验中，饲料中添加2.8%的乳酸，可以消除由于接种ST116所引起的临床症状，如腹泻和发热，并且能降低粪便中ST116的数量。

接种5 ml 5.6×107CFU/ml ST116后，饲料中未添加乳酸的实验组，都出现了腹泻和发热症状，而添加乳酸的实验组，未出现腹泻和发热症状。因此，在饲料中添加2.8%的乳酸能消除由于接种ST116所引起的临床症状。

在饲料中添加2.8%的乳酸，能降低实验组粪便中ST116的数量，这意味着乳酸能降低猪肠道中ST116的数量。这一结果解释了为什么乳酸能消除猪因接种ST116所引起的临床症状。在我们的实验中，盲肠中ST116的数量，LA-hiST组明显少于C-hiST组。Jorgensen等人[5]报道称，乳酸能降低沙门氏菌在养猪场的流行。本实验验证了乳酸能降低养猪场内沙门氏菌的数量，从而降低了沙门氏菌在养猪场的流行。

在比较低的pH值条件下，乳酸被认为具有杀菌作用。Jung等[6]报道称，猪的胃内pH值是3.82～4.07。在pH值为3.7时，乳酸作用3 h能将ST的数量降低100倍；在pH值为4.0时，乳酸作用3 h能将ST的数量降低10倍；在pH值为4.4时，乳酸对鼠伤寒沙门氏菌没有作用。因此，推测乳酸在猪胃里才具有杀菌作用。

在本实验中，接种ST116前，LA-hiST和 LA-loST实验组已经开始摄食加入乳酸的饲料，因此，这有可能引起肠道内短链脂肪酸的增多，从而改变肠道脂肪的组成，另外，肠道内原有的微生物群也有可能会被改变。Casey等人[5]报道称，乳酸在动物体内会被迅速的代谢成乙酸、丙酸和丁酸，这种变化会对ST有所影响。Van Immerseel等人[7]报道称，有机酸能干扰沙门氏菌基因表达，并且，乳酸能降低沙门氏菌在鸡肠道内定居的几率。具体的机制目前还不清楚，有待于进一步研究。

在以前的研究中，接种沙门氏菌后，粪便中沙门氏菌的含量会很快达到峰值[6]。但在本实验中，C-loST和C-hiST组接种鼠伤寒沙门氏菌后，其粪便中ST116的含量达到峰值的时间分别是接种后的第9 d和第12 d，此种现象的一个解释是应激反应[8]。但是，在本实验中，给予实验组猪的生活环境和喂食条件并没有变化，因此，我们可以排除应激反应导致猪粪便中ST116的含量峰值推迟的解释。C-loST组粪便中ST116的含量峰值出现在接种后的第9 d，猪体温的最高值出现在接种ST116后的第6 d，这表明在猪的肠道和身体其它部位，ST116的含量最大值出现在接种后的第6～9 d；C-hiST组粪便中ST116的含量峰值出现在接种ST116后的第3 d，猪体温的最高值出现在接种ST116后的第3 d，这表明在猪的肠道和身体其它部位，ST116的含量最大值出现在接种后的第2～3 d。C-hiST组粪便中ST116的含量峰值出现在接种后的第12 d，但是此时猪的体温并未上升，此种现象可能是因为在接种后的第12 d，ST116仅仅只在猪肠道内含量达到峰值，本实验还不能阐明这种现象的具体原因。

在本实验中，粪便中ST116的数量与接种剂量有关。接种5 ml 5.6×107CFU/ml的ST116后，饲料中未加乳酸的实验组都能分离出ST116，而饲料中加入乳酸的实验组，其中40%不能分离出ST116。因此，在饲料中添加2.8%的乳酸，能有效控制沙门氏菌在养猪场的传染。

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[5]Jørgensen L.Weaner feed that reduces Salmonella：the effects of the form of the feed and of addition of lactic acid on the prevalence of Salmonella,Lawsonia,gastro-intestinal health,and productivity[J].Danish Pig Production Report,2002,543.

[6]Jung Y S,et al.Sensitivity of multidrug-resistant Salmonella Typhimurium DT104 to organic acids and thermal inactivation in liquid egg products[J].Food Microbiol,2000,17：63-71.

[7]Van I F,et al.The use of organic acids to combat Salmonella in poultry：a mechanism of explanation of the efficacy[J].Avian Pathol,2006,35：182-188.

[8]Callaway T R,et al.Social stress increases fecal shedding of Salmonella Typhimurium by early wenaed piglets[J].Curr.Issues Intest.Microbiol,2006（70）：65-72.

（编辑：刘敏跃，lm-y@tom.com）

S816.75

A

1001-991X（2010）15-0057-04

刘国祥，河南金丹乳酸科技有限公司，工程师，477150，河南省郸城县金丹大道08号。

王文庆、申介健、赵港，单位及通讯地址同第一作者。

2010-04-14