噬菌体生物扩增法对结核病临床诊断的意义

张周云，熊国亮

(江西省胸科医院检验科，江西南昌 330006)

结核病是严重危害人类身体健康的全球性传染性疾病，我国结核病的发病率和病死率均较高，结核病的早期诊断和有效治疗是结核病疫情控制的关键。因此，寻找快速、准确可靠、阳性率高的检测方法是实验室研究的重要课题。为此我们应用噬菌体生物扩增法检测结核病的临床标本，并评价其对结核病临床诊断的应用价值，为结核的快速诊断提供新的检测手段。

1 资料与方法

1.1 一般资料 ①结核组：2007年6月至2008年10月为我院86例活动性肺结核患者痰标本、73例结核性胸膜炎患者胸水、30例肺结核患者肺泡灌洗液，共计189份临床标本，其中男121例、女68例，平均年龄46.3岁。②非结核组：7例COPD急性发作、3例急性支气管炎患者痰标本，5例肺癌患者胸水，5例尘肺患者肺泡灌洗液，共计20份非结核患者标本，其中男12例、女8例，平均年龄56.1岁。

1.2 试剂 (1)噬菌体检测试剂：分枝杆菌噬菌体D29、指示细胞(耻垢分枝杆菌)、液体培养基、噬菌体杀毒剂(硫酸亚铁胺)由英国BIOTEC Laboratories公司提供。(2)改良罗氏培养基按《结核病诊断细菌学检验规程》[1]自配。

1.3 方法

1.3 .1 噬菌体生物扩增法 按照FASTPlaque-TBTM试剂说明书配制所需试剂，包括痰、肺泡灌洗液等标本处理液，培养基，噬菌体，敏感细胞等，所有操作均在无菌条件下进行。①标本的前处理：待检痰标本、肺泡灌洗液先用3%NaOH溶液消化20min，再加磷酸盐缓冲液(pH 6.8)离心20min，弃上清液；胸水标本4000r/min、离心10min，弃上清液，沉淀加1～2ml 3%NaOH混匀去污染10min，4000r/min、离心10min，弃上清液；脑脊液直接离心去上清液。②用液体培养基洗涤以上沉淀物2次，最后加入1ml液体培养基重悬沉淀物(确保打散)，无菌条件下转移至反应管中为备用待检菌液。③取噬菌体0.1ml与待检菌液充分混匀，37℃孵育1h后加入0.1ml噬菌体杀毒剂，混匀，至室温5min后加入5ml液体培养基和1ml指示细胞，颠倒混匀一次。上述混合培养液与5ml已溶解琼脂液(55±2℃)混匀后立即倾入无菌平皿中，旋转混匀，待凝固成形后，平放于37℃培养箱中培养18～24h判读结果，每次检测要同时设阳性对照和阴性对照平皿。④结果观察：在各对照组结果正确的条件下，观察检测标本结果。阳性平皿中可见大小数量不等的透明状噬菌斑、或许多噬菌斑相互融合成透明状；阴性结果可见指示细胞在琼脂培养基中均匀分布、无噬菌斑出现。⑤结果判定：阳性结果≥20个噬菌斑；阴性结果＜20个噬菌斑。

1.3 .2同份标本同时进行离心涂片抗酸染色镜检，改良罗氏培养，其操作方法按《结核病诊断细菌学检验规程》[1]进行。

2 结果

2.1 三种方法对189例临床标本检出的阳性率分别为：噬菌体生物扩增法52.91%(100/189)；涂片抗酸染色15.34%(29/189)；罗氏培养27.51%(52/189)。噬菌体生物扩增法与涂片抗酸染色和罗氏培养阳性检测率比较，统计学有显著差异(χ2=59.32、P＜0.005，χ2=25.35、P＜0.005)。 结果详见表 1。

表1 三种方法对189例各类临床标本的检测结果

2.3 20例非结核患者标本噬菌体生物扩增法，涂片抗酸染色，罗氏培养均未检测出阳性。

3 讨论

3.1 目前，结核病的诊断方法很多，抗酸染色涂片法是目前最广泛采用方法之一，该方法检测速度快，价格低廉，能检出含菌量较高的标本，但对含菌量较低的胸腔积液、脑脊液等标本的检出率相对较低，无法早期诊断结核病。罗氏培养的阳性率虽高于涂片法但培养时间很长，难以达到临床上需要快速检测的目的。

3.2 近年来分枝杆菌噬菌体结核病快速诊断的研究报道很多[2～4]，该方法的基本原理是分枝杆菌噬菌体能感染活的分枝杆菌，未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活，已进入菌体内的噬菌体不受影响，噬菌体在感染菌体内大量增殖，并将菌体裂解，释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞，并将其裂解，在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑，因此，只要根据噬菌斑的有无即可判断待检标本中是否存在活的结核分枝杆菌，整个检测时间只需2天。本实验资料对189例临床结核标本进行检测结果：噬菌体生物扩增法阳性率52.91%(100/189)，远高于涂片抗酸染色阳性率15.34%(29/189)和罗氏培养阳性率27.51%(52/189)；特异性为100%。涂片抗酸染色和罗氏培养的阳性检出率都集中在痰液和肺泡灌洗液标本，但噬菌体生物扩增法不仅对痰液、肺泡灌洗液标本有较高的检出率而且对结核性胸膜炎患者胸水标本也有较高的检出率(49.30%)。

综上所述，噬菌体生物扩增法检测对结核病诊断具有快速、特异性和敏感性高的优点，该方法能为结核的快速诊断提供新的检测手段，并具有推广的应用价值。

[1]中国防痨协会.结核病诊断细菌学检验规程[J].中国防痨杂志,1996,18(1):28～31.

[2]McNerney R.TB:The return of the phage.A review of fifty years of mycobacteriophage research[J].Int Jtuberc Lung Dis,1999,3:179～184.

[3]靳安佳,王 洁,胡忠义，等.噬菌体生物扩增法检测肺结核患者痰标本临床应用研究[J].中华检验医学杂志,2005,28(8):807～808.

[4]四种检测方法对结核病临床诊断价值的探讨[J].中华检验医学杂志,2007,30(7):742～745.