应用噬菌体随机12肽库筛选TβRⅡ特异性序列

宗宪磊 姜笃银 蔡景龙 陈莹

应用噬菌体随机12肽库筛选TβRⅡ特异性序列

宗宪磊 姜笃银 蔡景龙 陈莹

目的从噬菌体随机12肽库中筛选TGF-β1Ⅱ型受体（TGF-beta receptorⅡ，TβRⅡ）的特异性序列，评估其对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用。方法以人TGF-β1单克隆抗体为靶，在噬菌体随机12肽库中进行4轮生物筛选；应用ELISA法挑选结合活性较好的单克隆噬菌体，进行DNA序列分析；MTT法评估TGF-β1单克隆噬菌体对瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学效应。结果测序共获得5种类似于TβRⅡ的特异性序列。MTT结果显示其中有3种噬菌体模拟肽能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。结论具有TβRⅡ特异性序列的噬菌体模拟肽能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。

噬菌体随机12肽库 转化生长因子-βⅡ型受体 瘢痕疙瘩成纤维细胞

创伤愈合与瘢痕形成密切相关，异常的创伤愈合常会导致增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成。研究表明，瘢痕疙瘩具有一定程度的肿瘤特性，防治仍十分困难，是目前研究的热点和难点[1-2]。转化生长因子-beta1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）是一种多功能的生长因子，与创面愈合和瘢痕形成密切相关[3-4]。阻断TGF-β1的信号通路是一种有效防治瘢痕疙瘩的办法[3-7]。TGF-βⅡ型受体 （TGF-β receptorⅡ，TβRⅡ）是TGF-β1的重要受体[5-6]，与TGF-β1的功能密切相关。噬菌体随机肽库是呈现特定长度的各种不同外源性多肽的噬菌体集合物。在M13噬菌体PⅢ基因的一侧随机插入特定长度的外源性的随机寡核苷酸，可以在噬菌体表面呈现出与PⅢ蛋白融合的随机多肽，构成完整的肽库。该方法已在受体阻断剂和激动剂的筛选和模拟、多肽疫苗和药物的研发等多个领域得到广泛应用[8-13]，如已从噬菌体随机肽库中筛选获得 CTGF[8]、EGF、VEGF和KGF[11-13]等多种生长因子的抗原表位。本实验拟从噬菌体随机12肽库中筛选出与TGF-β1单克隆抗体结合的TβRⅡ的特异性序列，并将其与瘢痕疙瘩成纤维细胞表面的TβRⅡ竞争性结合天然的TGF-β1，探讨其对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用，为瘢痕疙瘩防治开拓新的思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

噬菌体随机 12肽库试剂盒 （E.coli ER2738，NEB公司，美国），TGF-β1单克隆抗体（R&D公司，美国），TGF-β1 ELISA试剂盒（Sunbio公司，上海），IPTG（Merk公司，德国），PEG-8000（Amresco公司，美国），X-gal、BSA、MTT、DMSO（Sigma公司，美国），DMEM、FBS（Hycolone公司，美国），酶标仪（Bio-Rad公司，美国），恒温细菌摇床（江苏海门其林医用仪器厂，江苏），高速低温离心机（Hettich公司，德国），超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司，苏州），细菌培养箱（上海欧迈科学仪器有限公司，上海），细胞培养箱（Heraeus公司，德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 筛选

以人TGF-β1单克隆抗体包被96孔板，湿盒中4℃孵育过夜。0.5%的BSA 4℃封闭1 h。TBST洗板6次，加肽库，室温温和摇动1 h，TBST洗板10次，洗脱缓冲液 （0.2 mol/L Glycine-HCl，pH 2.2，0.1% BSA）洗脱结合的噬菌体，中和缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 9.1）快速中和洗脱物。对洗脱物进行扩增用于下一轮筛选。同样方法对每轮的洗脱物再进行3轮筛选，富集能够与TGF-β1单克隆抗体特异性结合的噬菌体模拟肽。对每一轮的洗脱物和扩增物进行滴度测定，计算每一轮筛选的噬菌体的产出/投入比，评估噬菌体的回收率。

1.2.2 噬菌体扩增

E.coli ER2738宿主菌划线接种于平板，倒置平板37℃培养过夜，挑取宿主菌单菌落于5 mL LB培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜，将培养物1∶100稀释于LB培养基，加入生物筛选洗脱物，37℃剧烈震荡培养5 h。10 000 g，4℃离心10 min，弃沉淀，上清液中加入PEG8000/NaCl，4℃过夜沉淀。10 000 g，4℃离心15 min，弃上清液，10 000 g，4℃离心30 sec，去上清，沉淀悬于1 mL TBS中，加入PEG8000/NaCl，冰育1 h。10 000 g，4℃离心10 min，弃上清液，沉淀悬于100 μL TBS/0.02%NaN3中，获得扩增的噬菌体。

1.2.3 噬菌体滴度测定

接种宿主菌单菌落于5 mL LB培养基中，37℃剧烈震荡培养5 h。应用LB对噬菌体进行10倍系列稀释。分别取各稀释度的噬菌体上清液10 μL与200 μL宿主菌培养液快速震荡混匀，室温孵育5 min，加入3 mL 45℃的上层琼脂中，快速振荡混匀，立即倾倒在37℃预温的LB/IPTG/X-gal平皿上，室温冷却5 min，37℃倒置培养过夜。含有噬菌体的菌斑显蓝色，计数蓝斑个数，计算出噬菌体滴度（Plaque forming units，Pfu）。

1.2.4 单克隆噬菌体扩增和ELISA检测

对第4轮的生物筛选物进行滴度测定，随机挑选噬菌体蓝斑，进行扩增，调整至2.0×1013pfu/mL。应用ELISA方法和人TGF-β1免疫测定试剂盒检测单克隆噬菌体的结合力。2倍稀释TGF-β1标准品，共获得7个稀释浓度（4 000～62.5 pg/mL）。添加各个稀释浓度的TGF-β1标准品或单克隆噬菌体，室温孵育2 h。应用洗涤缓冲液洗涤3次。添加抗人TGF-β1生物素，室温孵育1 h。应用洗涤缓冲液洗涤3次。添加HRP，室温避光孵育30 min。添加50 μL终止液。30 min内应用酶标仪测定其490 nm的吸光度值。

1.2.5 单克隆噬菌体DNA纯化和序列分析

噬菌体沉淀悬于100 μL碘化物缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mmol/L EDTA，4 mol/L NaI），加入250 μL乙醇，室温温育10 min，使蛋白保存于溶液中，DNA沉淀，离心10 min，应用70%乙醇洗沉淀，沉淀重悬于30 μL无菌双蒸水中。噬菌体DNA和-96 gⅢ测序引物一起送北京华大基因有限公司，进行染料示踪的双脱氧法自动测序。应用核酸Blast系统检测模拟肽DNA的相似性。

1.2.6 细胞系和培养方法

采用组织块培养法获得第3～5代瘢痕疙瘩成纤维细胞，应用含10%FBS的DMEM于37℃、5% CO2条件下进行培养[14]，所有培养基添加100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素。

1.2.7 细胞增殖检测

共设6组：噬菌体M13对照组和5组噬菌体模拟肽组（No.1～5）实验组，每组均设阴性参照。应用MTT方法定量测定瘢痕疙瘩成纤维细胞活细胞的数量。将取得的第3～5代瘢痕疙瘩成纤维细胞消化，重悬于含10%FBS的DMEM，接种于96孔板，每孔3 000个细胞。应用不含血清的培养基培养未融合的细胞24 h，使细胞同步化。换液，分别应用DMEM/0.5%FBS/PBS（阴性对照），DMEM/0.5%FBS/噬菌体M13（1012pfu/ml，1011pfu/ml和1010pfu/ml），含0.5%FBS的DMEM/5种噬菌体模拟肽 （No.1～5，1012pfu/mL，1011pfu/mL和1010pfu/mL）培养48 h，在培养的最后4 h添加MTT。移除培养基，每孔添加150 μL DMSO，应用酶标仪测定570 nm的吸光度值。

1.3 统计分析

实验结果以（平均值±标准差）表示，应用SPSS 16.0系统进行单因素方差分析法和Dunnet's检测方法分析各组间的差异显著性。P＜0.05时，差异具有显著性意义。

2 结果

2.1 噬菌体富集

在4轮生物筛选过程中每次投入的噬菌体的总量均为2×1012pfu，经过4轮生物淘选，获得的能够与TGF-β1单克隆抗体特异性结合的噬菌体的总量从1.36×106pfu（第 1轮）逐渐增加至 1.14×1010pfu（第4轮）。TGF-β1单克隆抗体特异性噬菌体的产率从6.80×10-7（第1轮）逐渐增加至5.70×10-3（第4轮）。通过4轮生物筛选，获得的噬菌体的特异性逐渐增强，总量逐渐增高，产出率逐渐增高，说明与TGF-β1单克隆抗体特异性结合的噬菌体模拟肽获得了富集（表 1）。

表 1生物淘选的噬菌体的回收率

2.2 ELISA

通过ELISA检测，获得TGF-β1的标准品吸光度值的曲线（图1）。对4轮生物筛选后获得的单克隆噬菌体进行ELISA检测，获得的单克隆噬菌体全部有良好的结合活性（吸光度值均≥0.246），吸光度值均高于250 ng/mL的TGF-β1标准品的吸光度值。证明生物筛选获得的单克隆噬菌体与TGF-β1单克隆抗体均具有较好的结合活性（表2）。

图1 TGF-β1的浓度-吸光度值

2.3 模拟肽DNA的序列分析

对22种单克隆噬菌体进行扩增，应用碘缓冲液提取法能够较好提取并纯化单克隆噬菌体DNA，进行琼脂糖凝胶电泳，可获得较好的DNA条带。测序共获得10种特异性的DNA序列，其中有5种序列与TβRⅡ及其前体相似（表2）。

2.4 细胞增殖检测

阴性参照和噬菌体M13对照组之间无显著性差异（P＞0.05），在阴性参照和3组低浓度噬菌体模拟肽组（No.2，1011pfu/mL和1010pfu/mL，No.3和No.5，1010pfu/mL）之间也不存在显著性差异（P＞0.05）。但是阴性参照和其他噬菌体模拟肽组之间存在显著性差异（P＜0.05），并呈剂量依赖性，其中3种噬菌体模拟肽（No.3～5）可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖（图2）。

图2 噬菌体模拟肽（No.1～5）对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖活性影响的MTT检测

表2模拟肽的DNA序列分析结果

3 讨论

TGF-β1是目前已知的与肿瘤关系极为密切的生长因子，其Ⅱ型受体（TβRⅡ）在TGF-β1信号传导、生物学效应等方面具有重要作用，TβRⅡ的变化影响着TGF-β1的功能[15]。研究表明，TGF-β1及TβRⅡ也与瘢痕疙瘩的发生和发展密切相关，TβRⅡ是TGF-β1促使瘢痕疙瘩形成的重要通路。与正常皮肤相比，瘢痕疙瘩表达高水平的TβRⅡ[8]，可能是瘢痕疙瘩具有一定程度肿瘤特性的重要因素[7-9,16-17]。蔡景龙[18]依据瘢痕疙瘩的临床表现、研究及治疗进展等方面，提出。姜笃银等[19]提出瘢痕疙瘩成纤维细胞具有凋亡抗性，可能是瘢痕疙瘩生长旺盛、具有侵袭性，并且不随时间消退的原因，这均与TGF-β1及其Ⅱ型受体有关。

本研究通过四轮生物筛选，TGF-β1特异性的噬菌体获得富集，ELISA的结果显示筛选的单克隆噬菌体均与TGF-β1单克隆抗体具有较好的结合力。测序和序列分析共获得5种类似于TβRⅡ的特异性序列。生物筛选过程是以TGF-β1单克隆抗体为靶，TβRⅡ的出现，可能是由于TGF-β1与其特异性的受体TβRⅡ有一定的相似性，或者二者具有能够互相结合的空间构象，这些序列也能够与TGF-β1单克隆抗体相结合。MTT检测数据显示，有4种噬菌体模拟肽能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，并呈剂量依赖性。这可能是通过与野生型的TβRⅡ竞争性结合TGF-β1，中和了部分TGF-β1，降低TGF-β1的有效浓度，干扰了TGF-β1信号通路，从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖。通过部分阻断TGF-β1的信号通路，可能有助于了解瘢痕疙瘩的发生和发展的机制，探讨防治瘢痕疙瘩的方法，可能有助于改善瘢痕疙瘩的肿瘤方面的临床表现（如促进其消退，避免浸润性生长，避免复发等）。今后需进行信号通路方面的深入研究，并进行动物实验来加以验证。

本实验从噬菌体随机12肽库中筛选了5种类似于TβRⅡ的特异性序列，并证实其中有3种能够抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，提示我们通过干扰TGF-β1信号通路，可能有助于深入了解TGF-β1信号通路与瘢痕疙瘩的发生和发展的关系，选择TβRⅡ的特异性序列，有望研制出防治瘢痕疙瘩的新型药物，为防治瘢痕疙瘩提供了新的策略。

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Isolation of Specific Sequence of TGF-β ReceptorⅡ Using a Phage 12-mer Display Peptide Library

ZONG

Xianlei1,JIANG Duyin2,CAI Jinglong1,CHEN Ying1.
1 Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy Medical Sciences,Beijing 100144,China;2 Institute of Tissue Engineering of Shandong University,Jinan 250033,China.Corresponding author:JIANG Duyin,CAI Jinglong.

Objective To isolate the specific sequence of TGF-β receptorⅡ (TβRⅡ)from a phage 12-mer display peptide library and to evaluate their effects on keloid fibroblasts. Methods A phage 12-mer display peptide library was screened for four rounds using monoclonal anti-human TGF-β1 as the target.ELISA was performed to select monoclonal phages with good association for DNA sequencing.MTT assay was used to detect the effects of monoclonal phages on keloid fibroblasts.Results Five specific sequences were obtained,which were similar to TβRⅡ.The results of MTT assay showed that three of the five phage model peptides could inhibit proliferation of keloid fibroblasts. Conclusion Phage model peptides with specific sequences of TβRⅡcan inhibit proliferation of keloid fibroblasts.

Phage 12-mer display peptide library; TGF-β receptorⅡ; Keloid fibroblast

Q781

A

1673－0364（2010）06－0323－04

2010年11月9日，

2010年11月26日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.006

国家自然科学基金资助项目（30772258，81071560）。

100144 北京市 中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院（宗宪磊，蔡景龙，陈莹）；250033 山东省济南市 山东大学组织工程研究所（姜笃银）。

姜笃银，蔡景龙。