镁黄长石浸提液影响人脂肪干细胞增殖和成骨分化的实验研究

谷辉杰 巩伦理 张昀 尹烁 常江 崔磊

·论著·

镁黄长石浸提液影响人脂肪干细胞增殖和成骨分化的实验研究

谷辉杰 巩伦理 张昀 尹烁 常江 崔磊

目的通过探讨不同浓度镁黄长石浸提液对人脂肪干细胞（Human adipose-derived stem cells，hADSCs）增殖和成骨分化的影响，初步阐明镁黄长石体外促进hADSCs成骨分化的机制。方法依照ISO/EN 10993-5标准，制备镁黄长石浸提液，将获得的hADSCs培养于不同浓度的浸提液中(1/2、1/4、1/8、1/16、1/32)，利用MTT法检测细胞的增殖情况；在成骨诱导条件下，通过碱性磷酸酶染色、活性检测和茜素红染色以及钙离子定量检测，观察不同浓度浸提液对hADSCs成骨特性的影响。结果1/2、1/4、1/8浓度的浸提液可以浓度依赖性地抑制hADSCs的体外增殖；1/4、1/8、1/16浓度的浸提液可以促进hADSCs的体外成骨分化；碱性磷酸酶染色和活性检测、茜素红染色和钙离子定量检测显示，1/4浓度的浸提液对hADSCs的体外成骨分化促进作用最强，此时的钙、镁和硅离子浓度分别为：2.36 mM、1.11 mM和1.03 mM。结论镁黄长石浸提液中的离子在适当浓度时，可以抑制hADSCs的体外增殖，同时促进hADSCs的体外成骨分化。

人脂肪干细胞 增殖 成骨分化 镁黄长石 浸提液

骨组织工程为骨缺损，特别是由原发肿瘤切除、 外伤、手术切除和矫形导致的临界大小骨缺损的修复和再生提供了新的治疗策略[1-2]。骨组织工程最基本的概念是将特定的细胞和合适的支架材料复合，在适当的环境条件下构建新的骨组织，然后用构建的骨组织修复骨缺损。用于骨组织工程的理想的人工合成生物材料支架必须具有以下一些特征：①足够的生物力学强度；②良好的生物相容性（包括骨连接性和骨诱导性等）；③可控的生物降解性；④三维多孔立体结构；⑤良好的可塑性；⑥可以消毒灭菌但不损失生物相容性；⑦降解产物没有毒副作用。生物陶瓷，如磷酸三钙和羟基磷灰石以及生物玻璃、透辉石和镁黄长石等[3-4]可以满足骨组织工程支架的大部分要求，从而广泛地应用于临床骨缺损的修复和治疗[2-3]。

镁黄长石（Ca2MgSi2O7）是一种含有钙、镁和硅的生物活性陶瓷，具有足够的力学强度、可控的降解速度、三维多孔结构和良好的生物相容性[4-6]，使其能够满足骨组织工程对细胞支架要求，从而在骨组织工程方面具有广阔的应用前景。我们先前的研究表明，相对于β-TCP，镁黄长石能够促进hADSCs在体外的成骨分化[7]。此外，Sun等[8]的研究表明，镁黄长石可以促进BMSCs在体外的细胞增殖和成骨分化。这些研究证明，镁黄长石具有良好的促进成体干细胞成骨分化的能力，但是调控这一过程的机制尚未阐明。

大量的证据表明，生物材料溶解出的离子能够促进成体干细胞细胞外矿化基质的形成，已有文献报道从陶瓷中析出的Ca、Si离子可以促进成骨细胞系的增殖和成骨相关基因的表达[9-10]。同时，还发现在材料中添加Mg离子可以促进成骨细胞的粘附和增殖[11]。因此，镁黄长石支架促进hADSCs成骨分化是否由其析出的离子导致，以及促进成骨这一过程的分子机制等方面有必要进行深入研究。

本实验研究中，我们利用不同稀释浓度的镁黄长石浸提液来探讨Ca、Mg、Si离子对hADSCs的增殖和成骨分化的影响。希望可以阐明Ca、Mg和Si离子对hADSCs成骨分化的联合作用，为设计开发更好的用于骨组织工程的支架材料提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

Ⅰ型胶原酶 （Washington Biochemical公司）；LG-DMEM（Gibco公司）；FBS（Hyclone公司）；红细胞裂解液、1,25-dihydroxyvitamin D3、β-glycerophosphate、茜素红染料、ALP染色试剂盒、PNP、p-nitrophenol(PNP)phosphate substrate、MTT；钙离子检测试剂盒（BioAssay Systems公司）。Varioskan全波段酶标仪 （Thermo Electron公司）；TE300型倒置相差显微镜（Nikon公司）。

1.2 hASCs的分离培养

新鲜人脂肪组织来源于上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科接受腹部脂肪抽吸术的健康女性，共5名，平均年龄30周岁。所有操作均获得上海交通大学医学院伦理委员会认可。按照文献描述分离培养hADSCs[12-13]，即脂肪抽吸获得物以等体积0.1 M PBS（pH 7.4）清洗3遍，以0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃振荡（120 r/min）条件下消化60 min，含10%FBS的LG-DMEM培养液终止消化，1 200 g离心10 min，获得高密度间质组织细胞团，并以红细胞裂解液处理5 min，除去掺杂的红细胞，过直径100 μm的筛网，以除去未完全消化的组织。所获得细胞以生长培养液重悬（GM：LG-DMEM，10%FBS，100 mg/mL链霉素，100 U/mL青霉素），4×104cells/cm2接种于直径100 mm的培养皿中，37℃、5%CO2、100%湿度条件下常规培养，每周换液2次。当细胞长至70%～80%融合时，以1∶3的比例传代。选用第3～5代细胞进行实验。

1.3 镁黄长石浸提液的制备

应用溶胶—凝胶法制备镁黄长石粉体[6]，依照ISO/EN 10993-5的浸提液制备标准[14]，将镁黄长石粉体加入到LG-DMEM培养液中进行制备，即：将镁黄长石粉体以200∶1的质量体积比（mg/mL）加入LG-DMEM的培养液中，37℃孵育24 h，将上述悬浊液高速离心，上清以0.22 μm的滤纸过滤消毒，以0.1 M的盐酸溶液调整pH值到7.4±0.5。得到的浸提液加入10%FBS作为初始浸提液。初始浸提液被GM培养液稀释X倍后记作“1/x浸提液”，用于之后的细胞实验。培养液中的Ca、Si、Mg离子浓度由电感耦合等离子体原子发射光谱法 （ICP-AES，Varian Co.）测得（表1）。

表1培养液中的Ca、Si、Mg离子浓度(mM)

1.4 成骨诱导方案

hADSCs以3×104cells/cm2密度接种，24 h后换成骨诱导培养液（OM：生长培养液或不同稀释浓度的浸提液，0.01 μM 1,25-dihydroxyvitamin D3，50 μM ascorbate-2-phosphate，10 mM β-glycerophosphate）进行培养。

1.5 细胞活性检测

将hADSCs按1 000个/孔接种于96孔板中，待24 h细胞贴壁后吸出原来的培养液，加入对应稀释倍数的浸提液100 μL代替。以GM培养液作为对照组。细胞培养1 d、3 d和7 d后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内的培养液。每孔中加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），置于摇床上低速震荡10 min，然后将液体移入另一新的96孔板中，在酶联免疫检测仪OD 490 nm处测量各孔吸光值。

1.6 碱性磷酸酶（ALP）染色及定量检测

依照Sigma Diagnostic Kit 85对成骨诱导后的hADSCs进行ALP染色。进行ALP的活性定量检测时，首先以冰冻PBS清洗细胞培养层，每孔加入1 mL细胞裂解液，以细胞刮子彻底刮下细胞层，移入1.5 mL离心管中，冰浴条件下以组织匀浆仪超声匀浆45 sec（每次连续超声5 sec，间隔5 sec）[15]。在4℃条件下12 000 r/min离心10 min，小心吸取上层蛋白溶液。移取0.1 mL蛋白溶液至15 mL离心管中，每管加入0.5 mL p-nitrophenol(PNP)phosphate底物溶液和0.5 mL碱性缓冲液，封盖，37℃温育15 min，每管加入1 mL 0.5 N NaOH溶液终止反应。移取200 μL反应终止液于透明96孔板中，以全波段酶标仪（Varioskan，Thermo Electron Corp.，USA）读取405 nm吸光值。另以PNP粉体制得不同浓度的标准PNP溶液，读取405 nm吸光值，绘制标准曲线。通过比对标准曲线，得到各反应终止液中PNP的含量。同时以BCA蛋白定量检测试剂盒测定各匀浆液中总蛋白的含量。细胞的ALP活性均以其总蛋白的含量进行归一，表示为nmol PNP/min/mg total protein，未接种细胞的板孔进行相同处理，其值作为空白对照值从以上所测的每个实验值中减去。

1.7 细胞外钙沉积检测

茜素红染色[16]：hADSCs成骨诱导一定时间后进行茜素红染色，95%乙醇固定10 min，PBS清洗2遍，1%茜素红-Tris-HCl溶液（pH 4.2）室温染色30 min，PBS彻底清洗，倒置相差显微镜观察、拍照。

细胞外钙沉积定量检测：接种于6孔板的细胞成骨诱导一定时间后，吸去培养液，用无钙、镁的PBS洗2遍，然后每孔加入0.1 N的盐酸1 mL，4℃作用4 h，吸取上清，12 000 r/min离心 5 min，依据QuantiChrom Calcium Assay Kit （BioAssay Systems Hayward，CA）说明书测定上清中钙离子的含量。收集细胞以BCA蛋白定量检测试剂盒测定各孔中蛋白的含量。细胞外钙沉积均以其总蛋白的含量进行归一，表示为μg/mg total protein。

1.8 统计分析

所有实验均重复3遍，数据以（均值±标准差）表示，采用方差齐性的独立样本t检验，统计软件为SPSS 11.0，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 浸提液对hADSCs增殖的影响

浸提液抑制hADSCs的增殖活性具有浓度依赖性。细胞接种后1 d、3 d和7 d后，MTT法检测显示，随着培养时间延长，在各个稀释倍数浸提液中培养的细胞均有增殖，接种后1 d、3 d各组细胞增殖与对照组没有显著差别。第7天时，随着浸提液浓度的增加，细胞增殖受到明显的抑制（图1）。在浓度为1/2的浸提液中，细胞增殖被抑制了40%，随着浸提液浓度的降低，抑制逐渐减轻，当浸提液浓度为1/16和1/32时，未观察到明显的细胞增殖抑制情况。

图1 浸提液对hADSCs活性的影响

2.2 浸提液对 hADSCs成骨过程中碱性磷酸酶（ALP）活性的影响

浸提液呈浓度依赖性促进hADSCs成骨过程中ALP的活性。体外培养10 d后进行ALP的染色观察发现，对照组（OM）的ALP染色阳性，不同浓度浸提液对hADSCs的成骨分化有促进作用，在1/4浓度时成骨促进作用最明显（图2A）。ALP定量结果显示，体外成骨诱导条件下，与OM组比较，1/4组和1/8组分别促进了碱性磷酸酶表达的78.2%和18.8%（图2B）。

2.3 浸提液促进细胞外钙沉积

体外培养14 d后进行茜素红染色观察发现，对照组（OM）细胞外基质钙特异性染色深，可见散在的钙结节。1/2组细胞外钙结节较对照组（OM）明显减少，在1/4～1/32组，随着浸提液浓度的增高，钙结节数量和大小逐渐增多。钙离子的定量检测结果显示，与对照组（OM）相比，1/2和1/32组无明显差异，1/4组、1/8组和1/16组的细胞外钙沉积分别增加了72.3%、23.4%和18.6%（图3B）。

图2 浸提液对于促进成骨诱导的hADSCs的ALP表达具有剂量依从性

图3 浸提液对于促进成骨诱导的hADSCs的细胞外钙沉积具有剂量依从性

3 讨论

镁黄长石是一种由钙、镁和硅组成的生物陶瓷，以往的研究已经成功制备了镁黄长石粉体[5-6]。当把镁黄长石浸泡在模拟体液中的时候，可检测出释放的可溶性钙、镁和硅离子，同时也可观察到表面形成的类骨质羟基磷灰石层[5]。我们早期研究表明，接种于镁黄长石陶瓷片表面的hADSCs较之接种于TCP表面的hADSCs有更强的成骨分化能力[7]。但是，镁黄长石促进hADSCs成骨分化的具体机制仍然不清楚，很难区分这种促进成骨分化的能力是由镁黄长石溶解出的钙、镁和硅等活性离子引起的，还是由材料表面的拓扑结构引起的。因此，为了阐明活性离子促进成骨诱导的作用，我们制备了镁黄长石的浸提液，并研究不同稀释浓度浸提液（1/2、1/4、1/8、1/16、1/32）对hASCs的增殖和成骨分化的影响。

已有研究表明，镁黄长石浸提液中的钙、镁和硅离子在某一浓度范围内能够促进BMSCs、骨母细胞和L929细胞的增殖[5-6]。本研究发现，镁黄长石浸提液抑制hADSCs的增殖，且这种抑制作用具有浓度依赖性。我们认为，这种现象可能是由于不同细胞对离子浓度的反应不一样导致的。同时我们也发现，高浓度的浸提液（1/2、1/4）并没有完全抑制hADSCs细胞的增殖作用，而细胞的成骨分化和细胞的增殖是一个平衡过程，高浓度浸提液对细胞增殖的抑制作用可能是由于其促进了细胞的成骨分化。

骨组织工程支架材料维持并促进细胞的成骨能力，是应用组织工程方法修复骨缺损的关键之一。本研究中，我们观察了还有钙、镁和硅离子的镁黄长石浸提液对hADSCs成骨分化的影响。我们发现浸提液可以促进hADSCs成骨分化，且这个促进作用具有浓度依赖性，当浸提液的浓度为1/4时，其中的钙、镁和硅离子浓度分别为2.36 mM、1.11 mM和1.03 mM，对hADSCs的成骨分化促进作用最明显，该结果和单个离子对细胞成骨分化作用结果是一致的。向培养液中添加钙离子或是从材料中析出的钙离子可以促进BMSCs、骨母细胞的体外成骨分化和矿质沉积[9,17]。已经证明硅在矿质结节的形成和Ⅰ型胶原、葡萄糖胺聚糖的合成中起重要作用[18-19]。镁是机体的一种重要无机元素，镁在细胞分化和血管组织钙化过程中发挥重要作用[11,20]。镁离子的缺乏可以引起骨形成障碍[21]。本实验发现，钙、镁和硅离子联合作用可以促进hADSCs的成骨分化。

综上所述，镁黄长石浸提液可以抑制hADSCs的增殖能力，且这种抑制具有浓度依赖性，浓度越大，抑制效果越明显。同时，镁黄长石浸提液可以促进hADSCs的成骨分化，这种促进同样具有浓度依赖性，当浸提液浓度为1/4时促进效果最明显。值得注意的是，浸提液在1/2浓度时对hADSCs增殖的抑制最明显，而对hADSCs的成骨分化没有明显的促进作用。我们的增殖实验结果和以往关于BMSCs等细胞研究的实验结果相反，提示不同的细胞对离子的反应不同。我们的研究证实了材料可以通过析出离子来影响细胞的增殖和分化，但其具体作用机制尚不清楚，需要进一步研究。同时，材料是否通过其他方式影响细胞的生物行为也需要进一步研究，以求阐明材料和细胞相互作用的机制，为骨组织工程的临床治疗提供理论依据。

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Experimental Study on the Effect of Extracts of Akermanite on Proliferation and Osteo-Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells

GU Huijie1,GONG Lunli1,ZHANG Yun1,YIN Shuo2,CHANG Jiang3,CUI Lei1,2.

1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai 200011, China;2 National Tissue Engineering Research and Development Center, Shanghai 200241, China; 3 Shanghai Institute of Ceramics, Chinese Academy of Science,Shanghai 200050,China.Corresponding author:CUI Lei.

Objective To elucidate the underlying mechanism of the osteo-differentiation of akermanite on human adipose-derived stem cells(hADSCs)via observing the effect of different diluted rate extracts on the proliferation and osteodifferentiation of hDASCs.Methods The original extract was prepared according to the ISO/EN 10993-5 and hDASCs were cultured in the different diluted rate extracts(1/2,1/4,1/8,1/16,1/32).The MTT assay was carried out to quantitatively evaluate the proliferation of the cells.Under the condition of osteo-induction,osteogenic differentiation of hADSCs cultured in the different extracts was detected by ALP expression and calcium deposition.Results The 1/2,1/4,1/8 extracts could concentration-dependently suppress the proliferation of hASCs,while the 1/4,1/8,1/16 extracts could promote the osteogenic differentiation of hADSCs.Among them,the 1/4 extract with the concentration of Ca2+,Mg2+and Si4+were 2.36 mM,1.11 mM, 1.03 mM,has the optimum one.Conclusion The ions in the extract of akermanite can suppress the proliferation of hADSCs while promoting the osteogenic differentiation of hADSCs in a suitable concentration.

Human adipose-derived stem cells(hADSCs);Proliferation;Osteogenic differentiation;Akermanite;Extract

Q813.1+1

A

1673－0364（2010）06－0301－05

2010年7月19日，

2010年9月24日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.001

国家自然科学基金（30672190和30730034)。

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科（谷辉杰，巩伦理，张昀，崔磊）；200235 上海市 组织工程国家工程研究中心（尹烁，崔磊）；200050 上海市 中国科学院上海硅酸盐研究所（常江）。

崔磊。