高效液相色谱法测定刺玫果中金丝桃苷的含量

钟方丽，王晓林*，敬采月

(吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

高效液相色谱法测定刺玫果中金丝桃苷的含量

钟方丽，王晓林*，敬采月

(吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

目的：建立刺玫果中金丝桃苷含量测定的方法。方法：采用高效液相色谱法测定，色谱柱为Shim-pack VP-ODS C18(4.6mm×150mm，5μm)；以甲醇(A)和0.2%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱，流速为1.0mL/min；进样量20μL；检测波长360nm；柱温40℃。结果：金丝桃苷进样质量浓度在4.76～76.16μg/mL范围内呈良好的线性关系，r=0.9993。平均回收率为98.06%，RSD为1.72%。结论：采用高效液相色谱法测定刺玫果中金丝桃苷的含量，方法简便、准确，可以用于刺玫果的质量控制。

刺玫果；金丝桃苷；高效液相色谱法

刺玫果系蔷薇科蔷薇属植物山刺玫(Rosa davurica Pall.)的成熟果实，又名野蔷薇果，是一种经济价值极高、药食同源的野生果类。广泛分布于东北及内蒙、山西等省。《中药大辞典》谓其有健脾理气、养血调经的作用[1]。刺玫果含有大量的维生素、氨基酸、黄酮类和鞣质类化合物[2]，现代药理学表明，黄酮类物质可加快血液流速，降低血液黏度，用于治疗脑血栓、脑动脉硬化及冠心病等，其中黄酮类成分——金丝桃苷对心肌缺血、脑缺血损伤均有保护作用，还具有调节免疫作用[3]。

目前，以天然刺玫果为主要成分的保健药物、保健食品、功能性饮料日益被人们所重视并广泛开发[4]。尚未见有关刺玫果中金丝桃苷含量测定的研究，本实验采用HPLC法测定刺玫果中金丝桃苷的含量，建立刺玫果中金丝桃苷的含量测定方法，为刺玫果的质量控制、综合利用与开发提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺玫果由延吉市林业局提供，经吉林化工学院生药学教研室鉴定为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫(Rosa davurica Pall.)的成熟果实。

金丝桃苷标准品(批号111521-200303) 中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯) 天津大茂化学试剂公司；水为重蒸馏水；其余所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20AB 型液相色谱仪、SPD-M20A 二极管阵列检测器 日本岛津仪器有限公司；Shim-pack VP-ODS C18色谱柱；BP211D 型电子天平 Sartorius公司；RT-08手提式高速中药粉碎机 大德乐机械有限公司；JBT/CYCL型超声波药品处理机 济宁金百特电子有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Shim-pack VP-ODS C18(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：A为甲醇，B为0.2%磷酸溶液(V/V)，程序为0～20min，10% A；20～40min，40%～70% A；40～55min，70%～90% A；55～60min，90%～10% A[5-7]；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：20μL；检测波长为 360nm。

1.3.2 标准品溶液的制备

精密称取金丝桃苷标准品适量，加甲醇配制成95.20μg/mL的溶液，作为标准品溶液[8-9]。

1.3.3 供试样品溶液的制备

精密称取2.50g刺玫果药粉，加入20mL甲醇，超声提取30min，过滤，收集提取液，滤渣加15mL甲醇，超声提取20min，过滤，合并两次提取液，过滤，转移至50mL容量瓶中并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 检测波长的选择

文献报道，采用高效液相色谱法测定金丝桃苷含量时，一般分别在350[6]、355[10]、360[11]、370nm[12]的检测波长条件下测定，本实验采用二极管阵列紫外检测器对金丝桃苷的标准品溶液在波长200～500nm范围内进行检测，发现金丝桃苷在360nm波长处有特征吸收峰，金丝桃苷在360nm处灵敏度较高，峰形较好，根据实验结果和参考文献[8]确定360nm为检测波长。

2.1.2 流动相条件的选择

本实验选择的流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液[6]，实验中分别考察等度洗脱和梯度洗脱两种方式，等度洗脱主要考察甲醇-0.2%磷酸溶液配比分别为35:65、40:60、50:50时金丝桃苷峰的出峰时间和峰型情况，结果配比为35:65时峰型较差，配比为50:50时出峰时间太短为3.287min，配比为40:60时出峰时间为6.8min，峰型较好，故选择甲醇-0.2%磷酸溶液(40:60)为流动相，虽然采用等度洗脱的方式出现的色谱峰型良好，标准品出峰时间在6.8min左右，但由于刺玫果为天然植物，成分复杂，在这样短的时间内可能会有一些物质没有分开而堆积到一起，金丝桃苷峰与其他组分不能有效分离，这样就不能保证实验的真实性和可靠性，于是在等度洗脱的基础上又进行梯度洗脱，而梯度洗脱金丝桃苷出峰时间约为26min左右，峰型良好，与其他组分能够有效分离，故以甲醇(A)和0.2%磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，并且对流动相的配比进行探索，结果以甲醇(A)和0.2%磷酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，程序为0～20min，10% A；20～40min，40%～70% A；40～55min，70%～90% A；55～60min，90%～10% A，在此条件下样品与标准品均分离较好，整个洗脱时间为65min，出峰时间约为26min左右，故选择在上述流动相条件下进行研究。

2.1.3 分离柱的选择

根据参考文献[10]，选择的色谱柱为Shim-pack VPODS C18(4.6mm×150mm，5μm)。

2.2 供试品溶液制备方法的选择

采用70%乙醇加热回流提取，甲醇超声提取两种方法处理样品，结果发现，两种方法所测出的金丝桃苷含量相差很少，但是甲醇超声提取方法较70%乙醇加热回流提取操作简单、损失较少，故确定超声提取方法作为供试品溶液处理方法。

2.2.1 提取次数的选择

精密称取5.0302g刺玫果粉末，分别提取1、2、3、4次，每次加入20mL甲醇，每次超声提取30min，过滤，收集各次提取液，将各次提取液分别置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，进行含量测定。由图1可知，第1、2次提取液测得的金丝桃苷峰面积分别为3703.5、1942.4，经计算提取率达97.5%，结果表明超声提取2次刺玫果中的金丝桃苷几乎提取完全。

图1 超声提取次数对金丝桃苷提取效果的影响Fig.1 Effect of ultrasonic extracting times on extraction efficiency of hyperin

2.2.2 提取时间的选择

在提取次数对提取效果的影响实验的基础上，进一步考察提取时间对提取效果的影响，精密称取5.0280g刺玫果粉末，提取2次，每次加入20mL甲醇，第1次提取30min，第2次分别提取10、20、30、40min，将第2次的提取液分别置于50mL容量瓶中，加甲醇定容。用微孔过滤器(0.45μm)过滤，取滤液作为供试品溶液，进行含量测定。由图2可知，超声提取20min，金丝桃苷含量与30min和40min很接近，故超声时间定为20min。

图2 超声提取时间对金丝桃苷提取效果的影响Fig.2 Effect of ultrasonic extracting time on extraction efficiency of hyperin

2.2.3 提取溶剂用量的选择

在提取次数、提取时间对提取效果影响的基础上，考察甲醇用量对提取效果的影响，精密称取5.0178g刺玫果粉末，提取2次，第1次加入20mL甲醇，提取30min，第2次分别加入甲醇10、15、20、25mL，提取20min，将第2次的提取液分别置于50mL容量瓶中，加甲醇定容，用微孔过滤器(0.45μm)过滤，取续滤液作为供试品溶液，按2.1节色谱条件进行含量测定。

图3 溶剂量对金丝桃苷提取效果的影响Fig.3 Effect of different volume of solvent on extraction efficiency of hyperin

由图3可知，溶剂用量为15、20、25mL时测得的金丝桃苷的量相差不大，因此选用15mL提取。最终确定供试品溶液的制备方法[6,13]为超声2次，第1次加入20mL甲醇，超声30min，第2次加入15mL甲醇，超声20min，合并提取液，过滤，转移至50mL容量瓶中并用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围考察

精密吸取金丝桃苷标准品溶液(95.20μg/mL)0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL，分别置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度4.76、9.52、19.04、38.08、57.12、76.16μg/mL的梯度溶液。分别精密吸取20μL，进行测定，记录峰面积，以金丝桃苷标准品进样质量浓度C(μg/mL)为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线[14]。得回归方程A=453.11C-331.80，r=0.9993，结果表明金丝桃苷进样质量浓度在4.76～76.16μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度实验

精密吸取质量浓度为19.04μg/mL的标准品溶液，连续进样5次，测定金丝桃苷吸收峰面积，RSD为1.06%，结果说明精密度良好。实验结果见表1。

表1 精密度实验Table 1 Precision test of this method

2.3.3 稳定性实验

取同一供试样品溶液，分别于0、2、4、6、8h进行测定，记录金丝桃苷吸收峰的峰面积，结果RSD为0.72%。结果表明样品溶液在8h内稳定。实验结果见表2。

表2 稳定性实验Table 2 Stability test of this method

2.3.4 重复性实验

取同一批刺玫果药粉，按1.3.3节方法制备5份供试品溶液，依法测定金丝桃苷的含量，记录金丝桃苷吸收峰的峰面积，结果RSD为1.60%。说明此方法重复性较好(表3)。

表3 重现性实验数据Table 3 Reproducibility test of this method

2.3.5 加样回收率实验

取已知含量(139.51μg/g)的样品5份，精密称定，分别精密加入金丝桃苷标准品溶液3.6mL，按1.3.3节方法制备5份供试品溶液，按1.3.1节色谱条件测定，结果表明平均回收率为98.06%，RSD为1.72%实验结果(表4)。

表4 回收率实验结果Table 4 Results of recovery experiments

2.4 样品测定

图4 金丝桃苷标准品溶液色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of hyperin reference solution

图5 供试品溶液色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of hyperin sample solution

分别取标准品溶液，供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图4、5。在此条件下供试品溶液中金丝桃苷的保留时间约为26min左右，分离度大于1.5，理论板数按金丝桃苷峰计算为7862，说明色谱条件适合本品的测定。

取3份刺玫果样品，按1.3.3节方法制备供试品溶液，测得金丝桃苷的含量分别为133.91、139.51、141.01μg/g。

3 结 论

本实验建立的含量测定方法操作合理简便，方法精密度高，重复性及线性关系良好，回收率较好，可为含刺玫果的中药制剂和功能性食品的含量测定提供依据。

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Determination of Hyperin in Rosa davurica Pall. by HPLC

ZHONG Fang-li，WANG Xiao-lin*，JING Cai-yue
(School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China)

Objective: To establish a determination method for hyperin in Rosa davurica Pall.. Methods: A HPLC method was developed using Shim-pack VP-ODS C18(4.6 mm × 150 mm, 5 μm) column as the stationary phase and CH3OH-0.2% H3PO4as the mobile phase. The flow rate of mobile phase, injection volume of the sample and the column temperature were 1.0 mL/min, 20 μL and 40 ℃, respectively. The UV detection wavelength was 360 nm. Results: A good linear relationship between integral value of peak area and hyperin concentration in the range of 4.76-76.16 μg/mL (r = 0.9993) was observed. The average recovery rate of hyperin was 98.06% with the RSD of 1.72%. Conclusion: The HPLC determination of hyperin in Rosa davurica Pall. was characteristics of convenience and accuracy, which can be used for the quality control of Rosa davurica Pall..

Rosa davurica Pall.；hyperin；HPLC method

TQ244.2

A

1002-6630(2010)24-0281-04

2010-02-08

吉林省教育厅重点计划项目(吉教科合字[2006]第122号)

钟方丽(1970—)，女，教授，博士，主要从事天然产物化学成分及其生物活性的研究。E-mail：fanglizhong@sina.com

*通信作者：王晓林(1969—)，男，副教授，硕士，主要从事天然产物有效成分的提取及纯化工艺研究。E-mail：wangxiaolin69@eyou.com