半胱氨酸蛋白酶抑制剂C研究进展

卢冬梅,宗春光,李 军,杨亚萍

(承德医学院附属医院，河北承德 067000)

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C研究进展

卢冬梅,宗春光,李 军,杨亚萍

(承德医学院附属医院，河北承德 067000)

细胞凋亡;凋亡基因;大肠癌

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C，Cys C）又称胱抑素C,是二十世纪60年代研究发现的一种广泛分布于动物、植物和原虫生物中低分子量蛋白质，具有能从肾小球自由滤过，不被肾小管重吸收和分泌的优点,并且肾脏是其唯一排出器官[1]。最近，以Cys C作为评价肾小球滤过功能较理想的内源性滤过标志物成为研究的热点,其在评价肾小球滤过功能方面起着重要作用。本文就Cys C与肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)之间的关系作一综述。

1 Cystatin C概述

1.1 Cys C命名、结构 1961年，Clauson首先从脑脊液中发现一种碱性蛋白，当时命名为γ-CSF。Cys C还有post-γ蛋白，γ-trace，γ-c-球蛋白等名称。1981年，检测了Cys C的氨基酸系列，但它没有显示与当时已知的任何超家族蛋白系列的同源性，事实证明它属于一个新的蛋白超家族。1983年，Anastasi等采用亲和层析的方法，首次在鸡蛋清中分离得到了两种不同PI值(6.5和5.6）的蛋白质。1984年命名为人Cys C。

Cys C是一个由122个氨基酸组成的小分子量，碱性非糖基化蛋白质，相对分子量为13359D，等电点(PI）为9.3，故带有正电荷。编码Cys C的基因位于人类第20p11上,长约4.3kb,包括3个外显子和2个内含子。Cys C在合成过程中先形成具有26个氨基酸的前体蛋白,进而形成一条分子内由二硫键连接的多肽链,人胱氨酸蛋白酶抑制剂家族目前由11种已经明确的蛋白组成，不同胱氨酸蛋白酶抑制剂在体液中的分布显著不同。Cys C作为看家基因(house-keeping gene）[2],广泛分布于所有有核细胞表面和各种体液中，如脑脊液、血液、尿液、唾液、泪液、精液、胸腹水等。以精液和脑脊液中浓度较高，精液中平均为51mg/L，脑脊液中浓度约为5.8 mg/L;正常血浆和羊水中Cys C浓度相近，约1.0 mg/L;在尿中浓度最低，平均尿浓度:血浆浓度为0.1:0.8 mg/L。在几乎所有组织恒定、持续转录及表达，无组织特异性，24小时昼夜节律变化波动很小，不足以影响试验结果。

1.2 Cys C功能 半胱氨酸蛋白酶主要存在于小动脉壁,是一种淀粉生成酶,产生淀粉样物质。Cys C是重要的胞外胱氨酸蛋白酶抑制剂，抑制内源性半胱氨酸蛋白酶的活性，对于细胞内蛋白质的转换，骨胶质的降解，蛋白质前体的分离有重要的作用。目前证明，它是对组织蛋白酶B(cathepsin B,CB）抑制作用最强的抑制物，对木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶H和L及二肽基肽酶I等也有抑制作用。也有文献报道Cys C有抗病毒和原虫感染的功能，且Cys C可以影响中性粒细胞的迁移[3]。Cys C产生不受炎症过程影响，因此不是急性时相蛋白。

Cys C相对分子量小，在体液的生理pH值中携带正电荷，可以被肾小球自由滤过;不被肾小管上皮细胞分泌，但在进曲小管有一定重吸收，之后被完全分解代谢，不会重新返回血流。Cys C的排出只受GFR的影响，不受性别、年龄、饮食、炎症、感染、血脂、肝脏疾病等其它因素的干扰。因此Cys C是反应GFR性质，评价肾小球滤过功能的良好指标。通常Cys C在尿中浓度很低，但在肾小管疾病或者肾实质受累时，滤出的Cys C超过了肾小管的重吸收能力时，尿中Cys C的浓度就会升高。

2 传统评价肾小球滤过功能指标的优缺点

以往评价肾小球滤过功能的指标有外源性标志物:菊粉清除率、放射性核素标记;内源性标志物:肌酐、尿素等。

2.1 外源性标志物

2.1.1 菊粉清除率(inulinclearance,Cin）:作为测定GFR的参考方法或金标准，但是本法操作复杂，既需要持续静脉滴注和多次抽血，又需留置导尿管，而且不适合糖尿病患者检测;同时，菊粉有时又会引起发热症状，所以临床上不能常规使用，仅供实验研究或者评估其它方法使用。

2.1.2 放射性核素标记物:如碘海醇(Iohexol),51Cr-EDTA,99m-二乙烯三胺戊乙酸(99m-Tc-DTPA）,碘酞盐(251I-iothalamatet）等，结果准确可靠，精密度高，但是病人需要接受放射性核素，对某些病人不能接受测定。核素标记物的价格相对较贵，对测定技术及设备要求较高。

2.2 内源性标志物

2.2.1 血 尿 素 氮(blood urea nitrogen，BUN）:BUN是 第一个用来评价肾功能的内源性物质，在肾小管被部分吸收，少量可以从胆道、汗液排泄;血尿素浓度除了受肾功能影响外，还受到蛋白质分解状况实际状况影响，如高蛋白饮食、胃肠道出血、口服类固醇激素时可出现血尿素增加。此外，血容量不足如高热、创伤时，除影响尿素从肾小球滤过，还可因促进抗利尿激素分泌，增加原尿中尿素重吸收，显著升高血尿素。因此尿素及BUN在评价GFR中敏感性和特异性不高。

2.2.2 血清肌酐(serum creatinine，SCr):SCr成为常用肾功能指标已经40余年，价格较低廉，当GFR降至正常的50%时，血肌酐浓度才明显上升;而且血肌酐浓度受年龄、性别、药物、饮食等影响，酮体、黄疸和乳糜时对肌酐也有干扰;计算肌酐清除率(CCr)时需要进行体表面积的校正，而且不易准确收集尿液等的影响，导致结果假性偏低或偏高。

2.2.3 尿酸(Uric acid, UA）:为核蛋白和核酸中嘌呤的代谢产物，既可来自体内，也可来自食物中嘌呤的分解代谢。血尿酸浓度受肾小球滤过功能和肾小管重吸收功能的影响，在肾小球滤过功能损伤时，血UA升高，其比SCr和BUN在反应早期肾小球滤过功能损伤上敏感。但是，其受食物和药物影响，在原发性和继发性痛风患者体内，UA升高。

另外，还有其它低分子量蛋白，如β2-微球蛋白(β2- Microglobulin protein,β2-MG)和视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein,RBP)等小分子蛋白，也是近年来逐渐用来评价GFR的灵敏指标。β2-MG每天在体内产生的速率较为恒定，且只被肾脏排泄，和GFR之间存在显著的相关性，但其浓度易受炎症、恶性肿瘤、狼疮、免疫抑制剂等多种因素影响。

3 Cys C与传统肾小球滤过功能检测标志物比较:

Cys C作为反映GFR的内源性标志物优点有:(1）产生恒定。由于Cys C基因属于看家基因，能在几乎所有的有核细胞细胞稳定表达，无组织特异性，故产生率相当恒定。(2)肾脏是清除循环中的Cys C的唯一器官。Cys C是低分子量蛋白质，可以经过肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾小管不分泌Cys C，所以血清中Cys C浓度主要由GFR来决定。(3) Cys C含量稳定，不受肌肉、年龄、性别、饮食和炎症等因素的影响。其与肌酐比较如附表所示:

4 Cys C与相关疾病的临床应用

附表 Scr和Cys C作为GFR的对比

Cys C检测GFR，与几种常见影响肾小球滤过功能的疾病有如下关联:

4.1 Cys C与原发性肾炎及肾病 Fiser等[4]研究表明,轻度肾功能损伤和高血压半伴轻度蛋白尿,但无肾功能不全病人,在GFR下降到88ml/min.1.73m时可见Cys C明显升高。而Scr水平在GFR下降到75ml/min.1.73m时才开始升高。

张磊等[5]检测84例各种肾脏病患者血清Cys C浓度，同时测定血清Scr及Ccr比较他们与GFR的相关性，结果发现三者与GFR均有显著相关性，而且以Cys C与GFR的相关程度最密切，说明血清Cys C是一个更为准确可靠的反映肾小球滤过功能的指标，对诊断各种不同肾脏疾病患者早期肾功能损害具有指导意义。

谢燕等[6]检测了慢性肾小球肾炎患者尿液中微量白蛋白(Microalbumin,MA)、转 铁 蛋 白(Transferrin, TRF)、免疫球蛋白(Immuneoglobulin,Ig)、RBP、α1-微球蛋白(α1-Microglobulin protein,α1-MG)及Cys C浓度，结果发现，47例慢性肾小球肾炎患者尿Cys C与RBP及α1-MA有显著相关性，尿Cys C可作为反映肾脏损害程度的指标。

4.2 Cys C与糖尿病肾病 糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病(Diabetes mellitus.DM）的严重并发症之一，也是导致DM病人死亡的主要死亡原因。因此，早期发现DM病人肾脏损害，并积极采取有效治疗措施，对阻止或延缓DN的发生具有重要临床价值。测定白蛋白排泄率(UAE）已经是目前公认的诊断DM的检测方法，但UAE的测定需要留取24h尿，不仅操作繁琐，而且不利于门诊病人留取标本。同时，尿微量白蛋白受到运动，尿路感染及全身性疾病的影响，昼夜排泄量不同。而Cys C却是在DN发生过程中有价值的监测指标。

Piwowar等[7]测定了41例2型糖尿病病人血浆β2-MG、Scr和 尿N-乙 酰-β-D半 乳 糖 苷 酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG）及Cys C，与对照组相比，所有参数都有统计学意义。在早期糖尿病肾病检测方面，血浆Cys C可能要比Scr、Ccr或β2-MG都要好些。

卞鲁岩等[8]采用颗粒增强透射免疫比浊法(PENIA）测定了67例DM病人血清Cys C浓度，同时测定UAE作为对照，以判断血清Cys C浓度在早期糖尿病肾病中的临床意义及应用价值。结果:UAE升高组，即早期糖尿病肾病组血清Cys C浓度均较UAE正常组明显升高，说明血清Cys C浓度升高可以作为诊断早期糖尿病肾病的一项指标，它和UAE有相同的临床意义，并且简便易行。

4.3 Cys C与类风湿性关节炎 类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA）是一个累及周围关节为主的多系统性自身免疫病，呈对称性、周围性、多个关节慢性炎性病变，临床表现为受累关节疼痛、肿胀、功能下降，病变呈持续、反复发作过程。本病的血管炎很少累及肾脏，若出现尿的异常则应考虑因抗风湿药物引起的肾脏损害，也可因长期类风湿关节炎而并发淀粉样变。

Mangge等[9]研究了56名病程超过5年,用非甾体抗炎药(NSAID)超过50个月以上的类风湿性关节炎患者血清Cys C,并与传统GFR指标SCr、CCr比较。结果56名患者只有3名SCr升高，而60%患者血清Cys C水平升高，说明在RA患者药物导致的肾脏损害中，Cys C可作为早期检测标志物。但是研究也发现，一些类风湿因子也能干扰微粒子增强透射比浊法，会使结果假性偏高。

Cys C是CB的天然抑制剂，近年发现CB和Cys C参与肿瘤的转移和浸润，提示该酶及其特异性抑制剂对细胞外基质(Extracellular matrix,ECM）代谢有重要作用[10]。Hansen等[11]为了比较RA滑膜中CB和Cystatin C表达，选取10名RA患者和健康人对照，用免疫组化方法检测滑膜中CB和Cys C，并研究表达两者的细胞类型。结果发现：RA滑膜中CB和Cys C高度表达，而且破坏的软骨和骨的纤维增生组织包含了CB和Cys C阳性的成纤维样和巨噬细胞样细胞，而正常组织细胞和分子表达很少。破骨细胞也有CB升高，但没有Cys C的表达，说明Cys C是巨噬细胞样和成纤维细胞样滑膜细胞的产物。RA患者关节滑膜中CB和Cys C强烈表达，尤其是在骨和软骨破坏的区域，表明尽管Cys C增加，但是不能防止基质的降解。

4.4 Cys C与肾移植 移植肾的肾功能随诊和检测非常重要，进行GFR检测可以作为衡量急、慢性排斥及对免疫抑制药物的肾毒性观察指标之一。在肾移植患者中，由于糖皮质激素应用引起的肌肉量减少，肌酐的小管分泌增加，或在排斥发作期间，用血肌酐可能不会准确估计GFR。而肌酐清除率的应用，在肾移植者有时由于尿量的变化，不易准确测出。因此，Cys C具有接近反映GFR的功能，可以作为在肾移植受者早期肾功能损害的一种观察指标。

Bricon等发现，肾移植后第四天，血浆Cys C水平比Cr下降急剧。在监测GFR下降方面，也是Cys C比血浆肌酐更好。在所有四起急性注射发作和一起急性肾毒性发作的研究中，发现血清Cys C的浓度与血浆肌酐的浓度在很大范围内保持一致，但是Cys C比Cr上升更明显。如果用Cys C作为指标的话，1例急性注射发作和急性肾毒性发作能较早的诊断出。在这些病人3个月的随访中，研究者对Cr-EDTA清除率、血浆Cys C、CCr和SCr各自作为GFR的标记物进行比较。结果显示：肌酐作为GFR的标记物造成30%-40%的高估率，并且有25%的假阳性，诊断准确性不理想；血清Cys C能很好反映GFR情况，且与Cr-EDTA清除率有很好的相关性，同时不容易引起假阴性。

Plebani等[12]对38例肾移植患者用三种方法进行检测，发现血清Cys C在肌酐清除率低于70ml/min.73m2时，其相关性较好，而当肌酐清除率高于70ml/min1.73m2时，与菊粉清除率有较好的相关性。Mendiluce[13]研究78名肾移植患者移植后第2、5、7、15天及1、6、12、18个月的血清Cys C、SCr及24小时CCr，结果发现，移植后30天内，SCr进行性下降，而Cys C到第5天才升高，与类固醇激素的应用剂量相符合。说明激素可引起Cys C生成明显增加，故在早期应用大剂量激素的患者中Cys C并不能较好的反映GFR的变化。Hocak[14]研究了460名患者及对照者，结果发现，炎症、免疫抑制药物影响Cys C在评价GFR方面的应用。因此，在肾移植方面还应继续积累研究成果。

4.5 Cys C与其它疾病 Cys C基因突变可引起常染色体显性遗传病冰岛型脑淀粉样血管病(ceretral amyloid angiopathy,Icelandic type.OMIM,105150）,或称为冰岛型遗传性脑出血伴淀粉样变(hereditary ceretral hemorrhage with amyloidosis Icelandic type,HCHWA-1），或 称 为 遗 传性Cystatin C淀 粉 样 血 管 病(hereditary cystatin C amyliod angiopathy,HCCAA）,病人平均在27岁左右发生第一次脑血管意外，病理示患者的淋巴组织、脾脏、唾液腺和精囊等处可发现淀粉样变。

在小于4岁的儿童中，以检测血肌酐来确定GFR相对困难。Fanos等[15]的研究表明:Cys C水平在出生后最高，可达1.64-2.59mg/L，随后几个月开始下降，到第五个月后趋于稳定，此时与成人的Cys C水平接近(0.7-1.38 mg/L）。这一变化过程又反映了肾脏滤过功能的成熟过程，所以，Cys C是一岁以上儿童更为理想的GFR检测标志物，受到临床儿科医生的重视。

尿Cys C是低分子量蛋白，可自由的被肾小球滤过，然后在近端肾小管上皮细胞吸收并迅速被分解代谢。如果肾小管功能受损，则不能及时代谢Cys C，所以，尿Cys C可以作为肾小管指标。但报道显示[16、17]，泌尿系统损伤过程中产生的蛋白分解酶能够降解Cys C，或者由于膀胱及尿道中存在的细菌和收集标本时污染的细菌分解Cys C，因此，在尿中检测Cys C的意义还有待于进一步探讨。血清中Cys C能够稳定存在，是因为血清中有抑制Cys C水解酶活性的抑制剂。

在对癌症病人化疗前和化疗期间的研究中[18]，发现血清Cys C比SCr更能够反映CCr下降的状况，尤其在肾衰竭的早期。研究者建议用血清Cys C代替CCr作为化疗前的筛选试验，也可用于GFR下降病人中的剂量的调整。

血清Cys C水平还与恶性肿瘤、心脑血管疾病、哮喘等疾病有关。甲状腺疾病中，有的报道甲状腺功能亢进，血清Cys C水平升高;甲状腺功能低下，血清血清Cys C浓度下降[19]。但是也有相反的报道[20]。

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