超声波对多酚氧化酶酶活力的影响及其机理

王文宗，李 琳，林鸿佳，陈 玲，李 冰*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

超声波对多酚氧化酶酶活力的影响及其机理

王文宗，李 琳，林鸿佳，陈 玲，李 冰*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640)

以多酚氧化酶(PPO)为对象，研究不同超声波条件对PPO酶活力的影响及其机理。结果表明：PPO酶活力随着超声时间增加而降低，随着超声波功率增大先略增大然后逐渐降低；在超声波作用下PPO的稳定温度和pH值分别为40℃和6.8；经超声波处理后的PPO，其动力学参数米氏常数Km增大、最大反应速率Vmax减小；PPO二级结构中β-转角相对减少。

PPO；超声波；酶活力

超声波是一种频率不小于20kHz的能量波，利用其振动能量，能在介质中产生强大的剪切力和高温，来改变物质组织结构、状态、功能[1]，加速或减慢这些改变过程，可以由此引发或强化物理、化学、生物等过程，通过提高或降低这些过程的质量和效率，达到其他处理技术难以达到的效果。随着超声波技术研究的不断深入，超声波技术已经广泛的应用于食品加工工业中[2-3]。近年来，食品中酶的超声活化和钝化成为研究热点，超声波对α-淀粉酶、糖化酶[4]、乙醛还原酶、溶菌酶[5]都有一定的抑制或激活的作用。

酶促褐变是果蔬汁加工、储藏过程中普遍存在的一种现象，不仅会改变果汁的色泽、风味，还会造成营养物质的流失，严重影响了食品的感官和营养品质。多酚氧化酶(polyphenel oxidase，PPO)是食品中引起酶促褐变的一种重要的酶。传统抑制果蔬汁酶促褐变的方法主要是加热处理、驱除氧气和添加褐变抑制剂等，但这些传统方法都存在一定的弊端。目前新兴的抑制酶促褐变的方法主要是物理法包括高静压法、高强度脉冲电场法、超滤法等。国外已将高静压法应用于果汁和果酱的生产，然而高静压法对设备的耐压能力要求高，使其在食品行业中的应用受到了很大的限制；国外对高强度脉冲电场法的研究已进入中试阶段，国内在这方面的研究尚属于起步阶段[6]；超滤法因其处理量小受到一定的限制。超声波对酶促褐变的影响未查到相关报道。超声波对酶作用是复杂的，既有抑制也有激活作用，这关键取决于超声波作用的条件以及酶的种类，因此，通

过控制超声作用条件，从而利用超声波处理对酶的效应来抑制果蔬汁的酶促褐变是可行的。通过超声波对鲜榨苹果汁进行处理，很大程度地降低了酶促褐变的速度，改善了果汁色泽，增强了果汁的稳定性。

研究不同超声波条件对PPO酶活力的影响程度以及影响机理，对抑制食品加工中酶促褐变具有重要的作用。因此，本研究以PPO为研究对象，研究超声波作用下不同超声波条件对PPO酶活力的影响，以及超声波作用下PPO二级结构的变化规律，从而阐明超声波对引起褐变的酶的影响机制，为食品加工过程中酶促褐变的抑制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PPO(1460U/mg) 美国Sigma公司分装；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 广州精科玻璃仪器有限公司；以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

VCX500超声波发生器 德国Sonics公司；UV-2102PC紫外分光光度计 上海尤尼柯有限公司；BS-300S精密电子天平 德国塞多利斯公司；MOS-450圆二色光谱仪 法国Bio-Logic公司。

1.3 方法

1.3.1 PPO酶活力的测定

采用分光光度计法，具体操作步骤参考Kruger等[7]的方法，并作部分修改。先将磷酸缓冲液、邻苯二酚溶液及酶液分别放入30℃恒温水浴锅中预热15min，取1.6mL 0.1mol/L pH6.8的磷酸缓冲液、1.2mL 0.1mol/L邻苯二酚及0.2mL酶液，混匀后立即在紫外分光光度计上于波长420nm处测定该混合体系的吸光度，同时开始计时。每隔1min记录一次吸光度，连续记录3min。按照同样方法平行测定3次。

1.3.2 不同超声波条件对PPO酶活力的研究

1.3.2.1 超声波功率密度对PPO活性的影响

固定超声波作用时间为4min，占空比为0.5(即超声波作用2s，停止2s)，超声波介质pH6.8，超声波介质温度为4℃，超声波功率密度分别为0、5、10、40、65、95、135W/cm2。

1.3.2.2 超声波作用时间对PPO活性的影响

固定超声波功率密度为65W/cm2，占空比为0.5，超声波介质pH6.8，超声波介质温度为4℃，超声波作用时间分别选取0、2、4、6、8、10、12min。

1.3.2.3 超声波介质pH值对PPO活性的影响

固定超声波功率密度为65W/cm2，超声波作用时间为4min，占空比为0.5，超声波介质温度为4℃，超声波介质pH值分别为3.5、6、6.8、7.4、8、9、10。

1.3.2.4 超声波介质温度对PPO活性的影响

固定超声波功率密度为65W/cm2，超声波作用时间为4min，占空比为0.5，超声波介质pH值为6.8，超声波介质温度分别为10、20、30、40、50、60℃。

1.3.3 PPO的动力学测定

采用不同浓度梯度的邻苯二酚溶液，测定PPO的动力学，用Line weaver-Burk双倒数作图模型[8]分别求出无超声波处理和经超声波处理(超声波介质温度为40℃，超声波介质pH6.8，超声波作用时间为4min，超声波功率密度为65W/cm2)PPO的米氏常数Km和最大反应速率Vmax。Km表示酶和底物之间的亲和能力；Vmax是酶被底物饱和时的反应速度。

1.3.4 PPO二级结构的测定

称取4mg PPO加入20mL 0.1mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲溶液，配成0.2mg/mL的PPO溶液经超声波处理(超声波功率密度为65W/cm2，超声波作用时间为4min，PPO溶液的温度为40℃，pH6.8)，以0.1mol/L，pH6.8的磷酸缓冲溶液为空白溶液测定其圆二光谱。利用该圆二色光谱仪所配置的软件包自动计算酶的二级结构各组分的百分含量。对比样品：0.2mg/mL的PPO溶液不经超声波作用直接测定其圆二光谱。

圆二色谱条件：扫描速度为100nm/min，带宽1.0nm；扫描范围190～250nm，重复扫描4次。

2 结果与分析

2.1 超声波处理条件对PPO酶活力的影响

2.1.1 超声波功率密度对PPO酶活力的影响

图1 超声波功率密度对PPO酶活力的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on the activity of PPO

由图1可见，当超声波功率密度小于10W/cm2，随着超声波功率密度的增大，PPO酶活力略有升高；而超声波功率密度大于10W/cm2，随着超声波功率密度的增大，其酶活力迅速降低。在超声波功率密度为40W/cm2时，其活性为原酶液的90.2%；而当超声波功率密度增

大至135W/cm2时，其活性仅为原酶液的33.8%。说明低强度的超声波对PPO有一定的激活作用，而高强度的超声波则会抑制PPO活性。超声波产生的机械传质作用和加热作用增加了底物分子与酶分子的能量，使其运动性加强，相互间碰撞的概率增大，同时也加强了介质与酶之间的传质扩散过程，超声波作用下产生的振动的气泡的周围界面有利于介质中的底物分子进入酶活性中心，也有利于产物分子进入介质，从而提高了酶促反应速度[9]。然而高强度超声波处理酶溶液时会出现空化效应，空化效应瞬间产生高温(大于5000K)、高压(大于5×107Pa)、高能量密度冲击波(可高达108N/m2)、微射流(速度达可400km/h)等极端物理作用[10]，而酶分子在强大的冲击波或射流的作用下，分子结构被破坏甚至被剪切成小碎片而表现出活力下降甚至失活[9]。这与文献[11]所报道“随着超声功率的增加SOD活性先增大后减小”的结论一致。

最后，教师引入自变量与因变量、无关变量与额外变量的概念进行归纳总结。学生理解各类变量概念以及变量之间的关系，学会确定变量。

2.1.2 超声波作用时间对PPO酶活力的影响

图2 超声波作用时间对PPO酶活力的影响Fig.2 Effect of ultrasonic exposure time on the activity of PPO

由图2可见，随着超声时间的增加，PPO酶活力呈现出下降的趋势。PPO经过6min的超声波处理后，其活性显著降低，活性为原酶液的42.5%。当超声处理时间超过6min时，随着时间的增加酶活力虽仍有略微的下降，但变化幅度较小，说明超声处理一定时间后，继续延长超声处理时间对PPO活性的影响较小。这与文献[12]所报道的随着超声时间的增加胰蛋白酶活性变化规律一致。这可能是因为超声波产生自由基和空化效应使PPO的构象产生了变化，从而使其酶活力在短时间内迅速降低；但由于酶的结构具有柔性，继续延长超声处理时间，对PPO结构不会再有太大影响。

2.1.3 超声波介质pH值对PPO酶活力的影响

由图3可见，当介质pH值为6.8时，PPO的活性最大，而一旦增加或减少介质的pH值，使其偏离6.8后，均表现出酶活力的下降。这说明超声波作用下PPO的稳定pH值为6.8左右，这与图3中无超声波作用下PPO稳定pH值为6.8，基本一致，由此可知，超声波作用并没有影响PPO的稳定pH值条件。

图3 超声波作用下pH值对PPO酶活力的影响Fig.3 Effect of pH on the activity of PPO with ultrasonic exposure

2.1.4 超声波介质温度对PPO酶活力的影响

图4 超声波作用下温度对PPO酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity of PPO with ultrasonic exposure

由图4可知，当温度为40℃时，PPO的酶活力最大；而低于40℃或高于40℃时，均表现为酶活力的下降；在温度为60℃时，PPO的活性基本消失。这说明PPO的酶活力最高温度为40℃左右，温度过低时，会使酶的活性受到抑制；而温度过高则会破坏酶的空间构象，造成酶的失活。无超声波作用的PPO的稳定温度为40℃，与经过超声波作用的PPO的酶稳定温度完全一致。由此可知，超声波并没有影响酶的稳定温度条件。

图5 无超声波作用下和经过超声波作用PPO酶活力动力学曲线Fig.5 Kinetic curves of PPO with and without ultrasonic exposure

由表1得知，无超声波作用的PPO的Km=0.94×10-2mol/L，Vmax=0.8652ΔA/min；经超声波作用的PPO的

Km=1.09×10-2mol/L，Vmax=0.7638ΔA/min。可以看出，经过超声波作用后的PPO的米氏常数Km有所增大，最大反应速率Vmax有所减小，这表明超声波作用使PPO与底物的亲和力减弱了。由于米氏常数只与酶的性质有关，在较高强度的超声作用下，酶分子的能量进一步加大，构象进一步改变，趋向不合理的构象，导致酶分子本身的催化活力受到阻碍[9]。因此，可推测超声波作用改变了PPO活性中心的结构或者是酶的构像，从而导致其与底物亲和力的改变。

表1 无超声波作用和经过超声波作用的PPO酶活力动力学参数Table 1 Kinetic parameters of PPO with and without ultrasonic exposure

2.3 超声波对PPO二级结构的影响

图6 无超声波作用与经过超声波作用PPO的圆二色谱图Fig.6 CD spectra of PPO with and without ultrasonic exposure

表2 PPO圆二色谱的分析结果Table 2 CD spectral data of PPO with and without ultrasonic exposure %

由表1可以看出，经超声波作用后PPO蛋白二级结构中α-螺旋、β-折叠结构略有减少，β-转角结构减少了4.2%，无规卷曲结构增加了约6.4%。蛋白质分子中α-螺旋和β-折叠的稳定性主要取决于分子内部的氢键。在酶蛋白的二级结构中，α-螺旋和β-折叠是维系其空间结构的骨架结构，其结构中存在较多的氢键，导致规则二级结构具有一定的稳定性和刚性；β-转角及无规卷曲中氢键作用微弱，使肽段中的各个残基间有更大的自由度[13]，因此，超声波产生强大的冲击波或射流[9]对β-转角结构的氢键影响较大，导致对PPO二级结构中β-转角结构破坏较大。

3 结 论

实验结果表明，采用不同条件的超声波处理，可以不同程度抑制PPO的酶活力。随着超声波功率的增大，PPO酶活力先略有升高，然后逐渐降低；PPO酶活力随着超声波作用时间的增大逐渐减小，而单一延长超声波处理的总时间，对PPO酶活力的影响较小。超声后的PPO的动力学参数Km增大、Vmax减少。通过圆二色谱分析可以看出，超声波是通过改变酶分子的结构进而影响其活性的。当超声波作用于酶溶液时，超声波释放的能量作用于酶分子，可能导致维持二级结构的氢键的断裂，导致部分构象发生变化，导致酶分子的构象趋于不合理，从而影响酶活力，抑制酶促反应。

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Effect and Mechanisms of Ultrasonic Treatment on Polyphenol Oxidase Activity

WANG Wen-zong，LI Lin，LIN Hong-jia，CHEN Ling，LI Bing*
(College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The effects of different ultrasonic treatment conditions on polyphenol oxidase (PPO) activity were investigated. Meanwhile, related mechanisms were explored. The results indicated that with prolonged ultrasonic treatment time, PPO activity initially increased, followed by a decrease. Higher ultrasonic power resulted in a slight increase followed by a gradual decrease. The stable temperature and pH for PPO treated by ultrasonic were respectively 40 ℃ and 6.8, respectively. After ultrasonic treatment, an increase in the Kmof PPO and a decrease in its Vmaxwere simultaneously observed, and the content of β-turn secondary structures decreased.

polyphenol oxidase；ultrasonic；enzyme activity

TS255.44

A

1002-6630(2010)17-0331-04

2010-06-29

国家“863”计划重点项目(2007AA100405)；广东省教育厅产学研基地科技成果转化重大项目(cgzhzd0704)；科技部国际科技合作计划项目(2009DFA32070)

王文宗(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为糖类物质及其药物的制备与生物利用。

E-mail：wangwenzong@126.com

*通信作者：李冰(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为糖类物质及其药物的制备与生物利用。

E-mail：bli@scut.edu.cn