烟碱协同过氧化氢对红酵母累积番茄红素的影响

王海兵，吴晓英*，梁文志，谢羽娜，袁思敏

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006)

烟碱协同过氧化氢对红酵母累积番茄红素的影响

王海兵，吴晓英*，梁文志，谢羽娜，袁思敏

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006)

研究烟碱、双氧水这两种效应物对红酵母发酵累积番茄红素的影响，发现其加入的量和加入的时间对累积量影响显著。结果表明，在红酵母发酵至36h时，同时加入2.5mL/L烟碱和1.6mL/L双氧水(含30%的过氧化氢)，可使番茄红素得到大量的积累，达到86.88mg/L，是不加烟碱和双氧水时番茄红素产量4.10mg/L的21.2倍。

红酵母；番茄红素；效应物；烟碱；过氧化氢

番茄红素是一种具有11个共轭双键的不饱和碳氢化合物，是类胡萝卜素的一种。作为一种天然脂溶性色素，番茄红素在自然界中分布广泛，主要存在于番茄、胡萝卜、西瓜、红色胡椒粉、红色葡萄柚以及红色棕榈油中。研究发现，番茄红素有很强的抗氧化作用，其对单线氧的消除能力是β-胡萝卜素的2倍，在类胡萝卜素中最强；同时番茄红素还具有对自由基的清除、阻断形成亚硝胺、对细胞增殖的抑制作用、诱导细胞分化、增加免疫力、减少DNA损伤以及促进细胞间隙连接通讯等作用[1-2]，是一种很重要的生物活性物质，并且在预防和治疗前列腺癌、乳腺癌等癌症，增强人体免疫功能以及心血管疾病方面有巨大的潜力[3]。

目前国内外应用的番茄红素的来源主要有两个方面：植物提取法和微生物发酵法。用植物提取法制取番茄红素，虽然原料来源广泛易得，但是含量较低、副产物较多，原料供应受到气候与季节的影响较大，使得生产成本较高；与此相比，微生物发酵法具有生产周期短、生产菌可基因改造而大幅提高产量、易于放大和工业化生产等优点，被广泛地应用于实际工业生产中。目前，生产天然类胡萝卜素的主要菌种为三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和红酵母(Rhodotorular)。虽然与三孢布拉氏霉相比，红酵母的单位产量比较低，但由于其具有营养要求简单、生长周期短及菌体营养丰富等许多优点，具有很高的实用价值和很好的工业开发前景。

一般情况下，微生物合成的主要类胡萝卜素，是番茄红素经过环化和氧化等之后的衍生物，如β-胡萝卜素、玉米黄素、虾青素等[4]。因此，针对类胡萝卜素这样的一个合成途径，可以从两个方面来提高番茄红素的累积：一是要加强和促进类胡萝卜素合成途径，二是要控制番茄红素后续的过程，阻止其环化反应。目前有人已开始尝试利用代谢控制手段，在微生物发酵法生产类胡萝卜素时，发酵到一定时间点时添加环化抑制

剂、氧化剂等效应物，使菌体产生和累积番茄红素[5-7]，取得了较好的结果。

过氧化氢有很好的氧化性，发酵过程中它的加入会使红酵母产生强烈的抗逆应激反应，大大促进其类胡萝卜素合成代谢的进行；烟碱是类胡萝卜素合成途径中番茄红素环化酶的良好抑制剂，它的加入可有效阻止途径中的环化反应，导致番茄红素的大量累积。本实验以黏红酵母为出发菌株，在优化的类胡萝卜素发酵条件下，分别考察加入不同烟碱量和同时加入不同的双氧水量对合成番茄红素的影响，并在不同的培养时间里，分别添加氧化剂双氧水和环化抑制剂烟碱两种效应物，以黏红酵母中的番茄红素达到大量积累。

1 材料与方法

1.1 菌株

本实验室筛选得到的一株类胡萝卜素高产菌黏红酵母2.27。

1.2 试剂与仪器

番茄红素标准品 上海融和医药公司；烟碱(95%)西安天则生物技术有限责任公司；双氧水(含体积分数30%H2O2的水溶液)。

SHP-450D型生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；SKYB2112B型恒温摇床 广州科桥实验技术设备有限公司；LD5-2A低速离心机 北京医用离心机厂；2802S型紫外分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司；1525型高效液相色谱仪、2487型紫外分光检测器 Waters公司。

1.3 培养基和培养方法

斜面活化培养基：葡萄糖2g/100mL、蛋白胨1g/100mL、酵母粉1g/100mL、琼脂2g/100mL、自然pH值。液体种子培养基：葡萄糖2g/100mL、蛋白胨1g/100mL、酵母粉1g/100mL、自然pH值。液体发酵培养基：葡萄糖5g/100mL、蛋白胨1.5g/100mL、酵母粉 1g/100mL、核黄素 0.5mg/L、吐温-80 1.5%(体积分数)、初始pH5。

种子斜面活化培养：挑黏红酵母一环，接入斜面活化培养基中，28℃培养48h；液体种子培养：从活化了的斜面种子中挑取培养物两环，接于装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶内，28℃条件下200r/min振荡培养24h；液体发酵培养：以5%的接种量，将液体种子接入到装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，在光照条件下，28℃，200r/min振荡培养96h。

1.4 生物量的测定

发酵结束后，取10mL发酵液转入离心管中，以4000r/min离心10min，弃上清液，沉淀水洗后再次离心，得酵母泥，于55℃过夜烘干，称干质量。

1.5 番茄红素的提取

发酵结束后，参照文献采用热酸法破壁[8]，丙酮浸提：取发酵液10mL转入离心管中，以4000r/min离心10min，沉淀水洗后得酵母泥；加入3mol/L的HCl溶液5mL，混合均匀后浸泡1.5h，然后再沸水浴4min，迅速冷却，再4000r/min离心20min，得沉淀水洗2次，离心得到菌体残片；加入丙酮9mL，混合均匀，浸提1h，4000r/min离心20min，得到色素丙酮浸提液。

1.6 番茄红素含量测定方法

将色素提取液用0.22μm的微孔滤膜过滤后，以高效液相色谱法(HPLC)测定提取液中番茄红素的含量。同时配制不同浓度的标准品溶液，在相同条件下测定，根据峰面积制备标准曲线定量。

Waters-1525高效液相色谱仪；色谱柱为：C-18硅胶柱(250mm×4.6mm，5μm)；Binary高效泵；检测器为：Waters-2487，DoubleλAbsorbance Detector；数据分析软件：Breeze。

高效液相色谱条件：流动相为乙腈和二氯甲烷，其体积比为10:90，检测波长为472nm，流速为1.0mL/min，柱温为28℃，进样量为10μL。

2 结果与分析

2.1 番茄红素标准曲线

准确称量2.5mg的番茄红素标准品，用丙酮溶解，定容于10mL的棕色容量瓶中，质量浓度为250μg/mL。再分别稀释成50、100、150、200、250μg/mL的质量浓度梯度，过滤后HPLC检测，数据处理，得到峰面积与质量浓度的关系曲线如图1。

图1 番茄红素标准曲线Fig.1 Standard curve of lycopene

2.2 环化酶抑制剂烟碱的加入量对番茄红素积累的影响

当液体发酵到48h时，加入不同量的烟碱，测定环化酶抑制剂的不同加入量对黏红酵母累积番茄红素的影响(见图2)。

从图2可以看出，随着环化酶抑制剂烟碱加入量的增加，黏红酵母菌体的生物量和番茄红素的累积量都先

增大后减小。在1.25mL/L的烟碱加入量时，黏红酵母生物量达到最大，为20.36g/L；在2.5mL/L的加入量时，番茄红素的累积量达到最大，为19.93mg/L。虽然2.5mL/L的烟碱加入量对黏红酵母的生物量的增加会有一定的不利影响，但却极大的促进了番茄红素的累积，因此，选择2.5mL/L为烟碱的最佳加入量。

图2 烟碱添加量对番茄红素合成的影响Fig.2 Effect of amount of individually added nicotine on the biosynthesis of lycopene

2.3 添加环化抑制剂烟碱的同时，氧化剂双氧水的加入量对番茄红素累积的影响

黏红酵母发酵的过程中，在发酵至48h时加入2.5mL/L烟碱的同时，加入不同量的双氧水(含30%H2O2的水溶液)，对黏红酵母累积番茄红素的影响见图3。

图3 H2O2添加量对番茄红素合成的影响Fig.3 Effect of amount of hydrogen peroxide added together with nicotine on the biosynthesis of lycopene

从图3可以看出，随着双氧水加入量的增加，黏红酵母的生物量呈现微弱增大的趋势，而番茄红素累积量则是先增大后减小。在3.2mL/L的双氧水加入量时，黏红酵母生物量达到最高，为22.34g/L；在1.6mL/L的加入量时，番茄红素的累积量达到最大，为65.84mg/L。在这种双氧水添加量比较小的情况下，双氧水的加入实际上增加了发酵液的溶氧含量，促进了菌体的生长，所以生物量随添加量的增大而增大；过氧化氢的氧化性刺激，激发了菌体的应激反应，促进了抗氧化性类胡萝卜素合成途径的进行，但过量过氧化氢又会消耗一部分生成的番茄红素，所以，番茄红素的累积量先上升后下降。综合考虑，选择双氧水1.6mL/L为最佳加入量。

2.4 环化抑制剂和双氧水不同时间加入对番茄红素累积的影响

液体发酵黏红酵母生产类胡萝卜素的过程中，分别在不同的时间点加入2.5mL/L的环化抑制剂烟碱和1.6mL/L的氧化剂双氧水，最后番茄红素的累积量见图4。

图4 两种效应物的加入时间对番茄红素合成的影响Fig.4 Effect of addition time point for the two effectors on the biosynthesis of lycopene

从图4可以看出，随着环化抑制剂与双氧水同时加入时间的推移，黏红酵母生物量是逐渐增大的，番茄红素的累积量先增大，后显著减小。在发酵至72h同时加入环化酶抑制剂和过氧化氢，菌体的生物量达到了最大，为22.19g/L；在发酵至36h时同时加入，番茄红素的累积量达到了最大，为86.88mg/L。

环化抑制剂和过氧化氢都会对菌体生物量的增加产生一定的不利作用，特别在发酵早期加入影响更大，而随着发酵时间的延长，菌龄的增长和菌体的成熟，其抗逆性也增强了，所以，后期的加入并不会显著影响菌体的生物量，因而出现菌体生物量随烟碱和过氧化氢加入时间的推移而增大；类胡萝卜素是黏红酵母的一种次生代谢产物，主要在发酵对数后期和稳定期时合成，因此必须在稳定期前加入环化抑制剂和过氧化氢，这样才能让番茄红素大量积累，所以出现在稳定期前加入以上两种效应物时，番茄红素的累积量大幅上升的现象。

图5、6、7分别是番茄红素标准品丙酮溶液、黏红酵母发酵至36h时同时添加了2.5mL/L的环化抑制剂烟碱和1.6mL/L的氧化剂双氧水的菌体丙酮浸提液和未添加烟碱和双氧水的发酵菌体丙酮浸提液在相同的色谱条件下，经过HPLC后得到的色谱图。

图5 番茄红素标准品的高效液相色谱图Fig.5 HPLC profile of lycopene standard

图6 发酵至36h时添加两种效应物的发酵菌体浸提液的高效液相色谱图Fig.6 HPLC profile of the extract from Rhodotorula cells with additions of the two effectors at 36 h of fermentation

图7 不加效应物的发酵菌体浸提液的高效液相色谱图Fig.7 HPLC profile of the extract from Rhodotorula cells without additions of the two effectors

从图5、6可以看出，添加了效应物的黏红酵母菌体的丙酮提取液中主要成分为番茄红素(保留时间分别为3.470min、3.506min，基本一致)，再根据图6、7的曲线比较，可以看到未添加效应物前，番茄红素含量很少，产物主要是环化和氧化了的类胡萝卜素，添加了效应物后，环化的类胡萝卜素大大减少了，而番茄红素量却显著增加。因此可以得出，烟碱和双氧水的加入极大的阻碍了类胡萝卜素合成中的环化过程，导致了大量番茄红素的累积。

3 结论与讨论

本研究以烟碱和双氧水作为效应物，在黏红酵母2.27发酵至36h时，向发酵培养基中同时添加2.5mL/L的环化抑制剂烟碱和1.6mL/L的氧化剂双氧水，可使菌体大量累积番茄红素，达到86.88mg/L，是不添加这两种物质时产量(4.10mg/L)的21.2倍。本研究中黏红酵母2.27番茄红素产量，比杨建明等[5]报道的红酵母番茄红素产量(11.79mg/L)、汪福源等[9]诱变得到的突变红酵母番茄红素产量(5.53mg/L)都高出很多；同时，由于烟碱易挥发，易溶于水，在色素提取中可方便去除；双氧水分解产物为水，安全无毒，可满足医药和食品行业对番茄红素生产的标准，可直接在实际生产中应用，因此，本研究结果对于进一步的生产应用有重要的参考价值。

随着大量研究工作的展开，类胡萝卜素的生物合成途径已经研究清楚，各反应中作为催化剂的酶的基因也已测序出来，为生产番茄红素提供了很好的借鉴。利用类胡萝卜素合成途径的代谢控制手段，可以尝试从以下几个方面去增加番茄红素的累积发酵水平[10]：1)构建新的代谢流来生产番茄红素。2)增强番茄红素合成代谢流：增加IPP 、GGPP 等前体底物的代谢流提高产量；寻找代谢途径的关键酶，加速限速反应，增强八氢番茄红素代谢流提高产量。3)打断其他竞争代谢流提高产量。

本研究就是利用烟碱作为环化抑制剂，打断了番茄红素继续转化成其他类胡萝卜素的代谢流；同时以双氧水为氧化剂，对黏红酵母的刺激增强了番茄红素的合成代谢流，才得以使番茄红素大量积累。从理论上讲，还可以利用基因敲除或iRNA沉默技术[11]，终止番茄红素环化酶基因的表达，使其得到积累，或者添加麦角固醇合成抑制剂[12]，阻抑麦角固醇的合成代谢，使两者共同前体累积，以此增加番茄红素合成，或者添加前体MVA合成酶的激活剂青霉素[13]，促进番茄红素的积累。目前的工作正在尝试从更多的方面加以实验，考察不同效应物以及它们之间的相互作用，以便将黏红酵母的番茄红素积累水平进一步提高。

[1] CLINTO S K. Lycopene: chemistry, biology, and implication for human health and disease[J]. Nutr Rev, 1998, 56(2): 35-51.

[2] BRAMLEY P M. Is lycopene beneficial to human health?[J]. Phytochemistry, 2000, 54(3): 233-236.

[3] POHAR K S, GONG M C, BAHNSON R, et al. Tomatoes, lycopene and prostate cancer: a clinician , s guide for counseling those at risk for prostate cancer[J].World J Urol, 2003, 21(1): 9-14.

[4] 徐志强, 余晓斌, 郑亚平. 类胡萝卜素代谢工程[J]. 天然产物研究与开发, 2003, 15(1): 259-263.

[5] 杨建明, 杨安全, 许激扬. 效应物促进红酵母累积番茄红素的工艺研究[J]. 药物生物技术, 2008, 15(3): 204-207.

[6] 修宇, 袁其朋. 烟草和MPTA对三孢布拉氏霉合成番茄红素的影响[J]. 北京化工大学学报: 自然科学版, 2009, 36(1): 80-84.

[7] 徐娜, 郑珩, 许激扬.环化酶抑制剂对三孢布拉氏霉生产番茄红素的影响[J]. 中国抗生素杂志, 2006, 31(6): 372-375.

[8] 杨文. 一种简单的胞壁破碎方法[J]. 微生物学通报, 1995, 22(1): 58-59.

[9] 汪福源, 许激扬, 唐宁. 诱变红酵母RY-17生物合成红酵母的研究[J].药物生物技术, 2005, 12(6): 375-378.

[10] 宋艳绒, 钟卫鸿, 路争. 代谢工程在微生物法生产番茄红素中的应用[J]. 工业微生物, 2006, 36(1): 60-64.

[11] 李晔, 赵杰, 袁其朋, 等. 番茄红素环化酶基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定[J]. 生物技术通报, 2006(4): 104-108.

[12] 汤峰, 周娴, 杨建明, 等. 麦角固醇合成抑制剂对促进红酵母累积番茄红素的研究[J]. 药物生物技术, 2009, 16(1): 64-67.

[13] 解书怀, 余晓斌, 顾秋亚. 代谢途径酶活促进剂对番茄红素发酵的影响[J]. 生物加工过程, 2008, 6(2): 17-21.

Effect of Simultaneous Additions of Nicotine and Hydrogen Peroxide on the Biosynthesis of Lycopene in Rhodotorula

WANG Hai-bing，WU Xiao-ying*，LIANG Wen-zhi，XIE Yu-na，YUAN Si-min
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The effect of simultaneously added nicotine and hydrogen peroxide on lycopene accumulation during Rhodotorula fermentation was explored. Amounts and addition time point of nicotine and hydrogen peroxide significantly affected the biosynthesis of lycopene during fermentation. A maximum lycopene content of 86.88 mg/L was achieved after Rhodotorula fermentation for 36 h with additions of 2.5 mL/L nicotine and 1.6 mL/L hydrogen peroxide, which was 21.2 times higher than that without additions of nicotine and hydrogen peroxide.

Rhodotorula；lycopene；effector；nicotine；hydrogen peroxide

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0254-04

2010-01-19

华南理工大学学生研究计划项目(SRP)

王海兵(1986—)，男，硕士研究生，主要从事生物制药研究。E-mail：2004seaside@163.com

*通信作者：吴晓英(1961—)，女，副教授，硕士，主要从事生物制药和生物活性物质的研究。

E-mail：xywu@scut.edu.cn