云芝(Coriolus versicolor)木质素过氧化物酶(LiP)酶学性质分析

金 剑，康文丽，生吉萍，程凡升，王权帅，张焱鑫，张国鹏，申 琳*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

云芝(Coriolus versicolor)木质素过氧化物酶(LiP)酶学性质分析

金 剑，康文丽，生吉萍，程凡升，王权帅，张焱鑫，张国鹏，申 琳*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

研究云芝(Coriolus versicolor)产木质素过氧化物酶(Lip)酶活力随时间的变化情况，以及温度、pH值、金属离子及化合物对云芝LiP酶活力和稳定性的影响，对该酶底物浓度效应和Km值进行测定。结果表明：云芝培养12d，其酶活力最高，为72U/mL。该酶的最适温度为40℃，在30～40℃范围内稳定；最适pH值为2.5，pH值在2.0～3.5较稳定；Zn2+对LiP有激活作用，Na+对酶活力没有影响，Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Cu2+及EDTA、SDS、β-巯基乙醇都表现出抑制作用；Km值为2.05×10-4mol/L。

云芝；木质素过氧化物酶；温度；pH值；Km

木质素是植物细胞中的主要成分之一，在食品工业副产物以及食品工业废渣中含有大量的木质素。自然界中，其数量仅次于纤维素，是潜力巨大的碳素资源，它主要是由不均匀、不规则的苯丙烷结构单元组成的芳香族高聚体。木质素和纤维素、半纤维素相互镶嵌、相互黏合组成立体网状结构，紧密结合细胞壁其他成分[1]。由于木质素结构复杂稳定，难于降解，成为自然界碳素循环的限速步骤[2]，因此，对木质素的生物降解成为当今世界在生物质能源的开发利用和环境污染控制方面的研究热点[3]。

木质素降解酶系[4]主要是木质素过氧化物酶(lignin peroxidase，LiP)、漆酶(laccase)和锰过氧化物酶(Mnperoxidase，MnP)。其中LiP主要是由真菌分泌，含有亚铁血红素辅基的糖基化蛋白酶，其最早是Kirk等[5]于1983年从黄孢原毛平革菌中发现，后来在多种白腐真菌中也有报道发现，其在生物制浆、有机污染物的降解以及环境污染控制等方面发挥重要作用[6-8]。由于LiP对底物没有特异性要求，其在食品加工过程中，如果汁澄清以及食品工业副产物的综合利用和食品工业废渣废液处理等方面应用潜力巨大。

云芝又称彩云革盖菌，别名杂色云芝(Coriolus versicolor)，是多孔菌科真菌云芝属的子实体[9]，其次

生代谢过程中能产生木质素降解酶系。本实验研究云芝LiP的酶学性质，对云芝的开发利用和LiP的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

云芝菌种购买于中国农业菌种保藏中心(ACCC 50435)。

PDA培养基用于菌种活化；高碳低氮[10]培养基用于产酶：每升培养基中含葡萄糖20.0g、氯化铵0.3g、KH2PO44.0g、MgSO4·7H2O 0.3g、CaCl20.3g、藜芦醇0.182g。

1.2 试剂

天青B、藜芦醇 美国Sigma公司；其余试剂为国产分析纯。

1.3 仪器与设备

UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计(配有UNICO分光光度计应用软件) 尤尼柯(上海)仪器有限公司；DKZ系列电热恒温振荡水槽 上海一恒科技有限公司；PB-10 pH计 德国Sartorius公司。

1.4 方法

1.4.1 云芝LiP的培养方法和酶液制备

在250mL三角瓶中放入30mL产酶的培养基，接种直径为8mm的云芝菌块，于28℃、170r/min条件下摇床培养。取培养液，于4℃、10000r/min离心10min，取上清液为粗酶液，－80℃保存待用。

1.4.2 云芝LiP酶活力测定

反应体系中含酶液0.5mL，4mmol/L藜芦醇0.4mL，酒石酸缓冲液2.0mL(pH2.5)，于30℃条件下加入0.1mL 15mmol/L的双氧水启动反应，于310nm波长处测定反应最初3min内的吸光度变化[11]。

酶活力定义为：30℃时每分钟使1μmol的藜芦醇转化为藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

1.4.3 培养时间对云芝LiP酶活力的影响

在250mL三角瓶中放入30mL产酶的培养基，接种直径为8mm的云芝菌块，于28℃、170r/min条件下摇床培养，每2d取样，测定不同时间云芝LiP的酶活力。

1.4.4 云芝LiP最适温度的选择

分别将酶液置于20、30、40、50、60℃，测定各温度下的酶活力，以酶活力最高者计算相对酶活力。

1.4.5 云芝LiP温度稳定性研究

分别将酶液置于20、30、40、50、60℃条件下保温2h，测定各温度下的酶活力，以各温度最初酶活力计算相对剩余酶活力。

1.4.6 云芝LiP最适pH值的选择

将酶活力测定方法中的缓冲液改用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，取适量酶液置于pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，测定各pH值下的酶活力，以酶活力最高者计算相对酶活力。

1.4.7 云芝LiP的pH值稳定性研究

在1.4.6节条件下，将酶液置于pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0条件下，于30℃保持4h，测定各pH值下的酶活力，以不同pH值条件下最初酶活力计算相对剩余酶活力。

1.4.8 金属离子及化合物对云芝LiP的影响

在酶液中分别加入EDTA、SDS、β-巯基乙醇、CaCl2、KCl、MgCl2、MnCl2、NaCl、CuCl2、ZnCl2至终浓度为5mmol/L，于30℃保持30min，以未添加金属离子及化合物的酶液为对照，测定各种金属离子及化合物下的酶活力，以未添加金属及化合物离子及化合物酶液的酶活力计算其相对剩余酶活力。

1.4.9 底物浓度效应

以天青B为底物，分别配制不同浓度的底物，使之与酶液反应，测定酶反应速度。用双倒数作图法求出酶对该底物的Km值。

1.5 相对酶活力和相对剩余酶活力的计算

式中：1.4.4、1.4.6节方法中，A为各温度或pH值下的酶活力；B为各温度或pH值下的最高酶活力。

式中：1.4.5、1.4.7、1.4.8节方法中，C为各温度、pH值以及金属离子处理一段时间后的酶活力；D为各温度、pH值以及未添加离子处理时的最初酶活力。

2 结果与分析

2.1 培养时间对云芝LiP酶活力的影响

图1 培养时间对云芝LiP酶活力的影响Fig.1 Effect of incubation time on LiP production

如图1所示，云芝在产酶培养基上随着时间的变化，产酶量不同。在第12天达到产酶高峰，为72U/mL。故选取第12天的发酵液进行后续实验。

2.2 温度对云芝LiP酶活力的影响

图2 温度对云芝LiP酶活力的影响Fig.2 Effect of incubation temperature on LiP production

如图2所示，LiP对温度比较敏感，在30～40℃之间有较高的活力，40℃时酶活力最高。而在其他作用温度下酶活力较低，20℃时酶活力是40℃时的46%，50℃时的酶活力是40℃时的56%。

2.3 云芝LiP的热稳定性

图3 云芝LiP的热稳定性Fig.3 Thermal stability of LiP from C. versicolor

如图3所示，云芝LiP在低温下稳定，20、30、40℃条件下保持2h，其酶活力基本不下降。当温度高于40℃时酶活力迅速下降，在50℃保持2h后，其相对剩余酶活力为63%，而在60℃时保持2h后，其相对剩余酶活力仅7%。

2.4 pH值对云芝LiP酶活力的影响

图4 pH值对云芝LiP酶活力的影响Fig.4 Effect of pH on the activity of LiP from C. versicolor

如图4所示，LiP在强酸性条件下酶活力较高，最适pH值为2.5，在pH值大于3.5时酶活力迅速下降，在pH值为5.0时，其相对酶活力为19%。

2.5 云芝LiP的pH值稳定性

图5 云芝LiP云芝的pH值稳定性Fig.5 pH stability of LiP from C. versicolor

由图5可知，云芝LiP在不同pH值条件下30℃保温4h，酶活力都有明显下降。在pH2.0～3.5范围内其相对酶活力相对稳定，相对剩余酶活力在50%以上。在pH值大于4.0时，相对剩余酶活力下降迅速，在pH值大于5.0时，已经检测不到剩余酶活力。

2.6 金属离子及化合物对云芝LiP酶活力的影响

图6 不同金属离子及化合物对云芝LiP的影响Fig.6 Effects of metal ions and compounds on the activity of LiP from C. versicolor

如图6所示，金属离子及化合物对LiP有明显的激活或抑制作用。当离子浓度为5mmol/L时，只有Zn2+表现出激活作用，酶活力提高了20%；Na+对酶活力没有影响；其他金属离子及化合物均表现出抑制作用，其中，Mg2+作用下的剩余相对酶活力只有8%，SDS作用下完全检测不到酶活力。可见，云芝LiP在外界条件下容易受到抑制而降低酶活力。

2.7 云芝LiP的底物浓度效应

以该酶不同底物浓度为横坐标，其相对反应速率为纵坐标作图，结果如图7所示。当天青B浓度低时，反应速率与底物浓度的关系基本呈正比关系，表现为一级反应，随着天青B浓度的增加，反应速率不再上升，趋向于1个极限，说明云芝LiP被天青B所饱和，表现

为零级反应。根据Lineweaver-Burk双倒数法作图，可以求得该云芝LiP的Km为2.05×10-4mol/L(图8)。

图7 底物浓度效应Fig.7 Effect of substrate concentration on the relative reaction velocity of LiP from C. versicolor

图8 Lineweaver-Burk双倒数作图法求Km值Fig.8 Determination of Km based on Lineweaver-Burk plot

3 讨 论

本实验研究发现云芝LiP的最适温度为40℃，Aitken等[12]研究的黄孢原毛平革菌LiP的最适温度为25℃，可见，云芝LiP能够更好的适应较高的温度环境。杨金水等[13]研究的斜卧青霉LiP最适温度为45℃，在55℃时，其相对热稳定性只有62.5%，同样有徐淑霞等[14]报道黄孢原毛平革菌LiP在55℃时酶活完全被抑制，这些与云芝LiP的温度稳定性基本一致，可见LiP是一个不耐高温的酶。LiP的pH值作用范围一般属于严格的酸性环境，如杨金水等[13]研究的斜卧青霉LiP的最适pH值为4.0，Aitken等[12]研究的黄孢原毛平革菌LiP的最适pH值为4.5。云芝LiP的最适pH值在2.5，具有很强的耐酸性。但LiP在此条件下稳定性不高，这极大地限制了LiP开发利用。对于实验研究的云芝LiP，只有Zn2+表现出了对酶活的促进作用，Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Cu2+及EDTA、SDS、β-巯基乙醇都表现出抑制作用，这与其他报道有很大不同[14-15]。由于实验产酶培养基中含有藜芦醇，所以在底物浓度效应中选用的底物为天青B。Km为2.05×10-4mol/L，表明云芝LiP对天青B具有较强的特异性，说明天青B可以作为LiP的酶活测定底物。该云芝LiP的产量达到了7.19×104U/L，具有很好的开发潜力，但是由于其不稳定，以往关于其性质及应用的研究并不多，为此，进一步提高酶活力、维持酶活性稳定的研究可谓具有重要的意义。

实验初步研究了云芝LiP的酶学性质，发现其具有不稳定性。考虑到实验所用酶液为粗酶液，其中存在较多酶失活因素，建议进一步研究时将酶液纯化，以便更好地实现云芝LiP的开发利用。

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Enzymological Characteristics of Lignin Peroxidase (LiP) from Coriolus versicolor

JIN Jian，KANG Wen-li，SHENG Ji-ping，CHENG Fan-sheng，WANG Quan-shuai，ZHANG Yan-xin，ZHANG Guo-peng，SHEN Lin*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

In this paper, the enzymological characteristics of lignin peroxidase (LiP) from C. versicolor were investigated. The effects of temperature, pH, metal ions and compounds on the activity and stability of the enzyme were explored. Meanwhile, the relationship between substrate concentration and LiP activity was also studied, and the enzyme was measured for its Km. The highest enzyme activity was 72 U/mL when C. versicolor was cultured for up to 12 days. The optimal temperature and pH of the enzyme were 40 ℃ and 2.5, respectively. It exhibited a good stability in a range from 30 to 40 ℃ for temperature and from 2.0 to 3.5 for pH. Its activity could be activated by Zn2+and inhibited by Ca2+, K+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, EDTA, SDS and β-mercaptoethanol, while Na+had no effect on its activity. The Km of the enzyme was 2.05 × 10-4mol/L.

Coriolus versicolor；lignin peroxidase；temperature；pH；Km

Q554.6

A

1002-6630(2010)17-0224-04

2010-03-31

教育部大学生科学研究与创业计划建设项目；国家公益性行业(农业)科技项目(200803033)

金剑(1987—)，男，本科生，研究方向为农产品综合利用。E-mail：flying364@163.com

*通信作者：申琳(1964—)，男，副教授，博士，研究方向为农产品综合利用。E-mail：pingshen@cau.edu.cn