猪牙花乙醇提取物抑菌活性、抗氧化作用及猪牙花中微量元素的测定

蔡恩博，赵 岩，杨智慧，田 阳，陈红梅，高 瑜，吴 谦，郑友兰*

(吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118)

猪牙花乙醇提取物抑菌活性、抗氧化作用及猪牙花中微量元素的测定

蔡恩博，赵 岩，杨智慧，田 阳，陈红梅，高 瑜，吴 谦，郑友兰*

(吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118)

目的：对猪牙花乙醇提取物的抑菌活性、抗氧化作用进行研究，并测定猪牙花中微量元素的含量。方法：以猪牙花全草80%乙醇提取物为材料，采用滤纸片法对4种常见细菌的生长抑制活性、最低抑菌浓度进行测定，并讨论温度、pH值及紫外线对提取物抑菌效果的影响；采用羟自由基法测定其抗氧化作用；采用原子吸收分光光度法测定其微量元素铁、锰、锌、铜的含量，采用SPSS16.0统计分析软件对实验结果进行统计分析。结果：猪牙花全草80%乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度为12.5mg/mL，对沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌质量浓度均为100mg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为200mg/mL。热处理、酸性环境、紫外照射等对抑菌作用均无明显影响。猪牙花提取液在0.0025～0.32mg/mL的质量浓度范围内，其清除率达到64.57%。其提取物IC50值为0.051mg/mL。微量元素Fe含量为633.25μg/g；Mn为30.45μg/g；Zn为39.95μg/g；Cu为12μg/g。结论：猪牙花80%乙醇提取物有着良好的抑菌效果及较强的抗氧化作用，且猪牙花中微量元素含量较高，具有很大的开发价值。

猪牙花；抑菌；抗氧化；微量元素

猪牙花(Erythronium japonicum Decne.)为百合科(Liliaceae)猪牙花属(Erythronium)多年生草本植物。生于林下湿地。分布于我国东北地区；朝鲜，日本也有分布[1]。现代研究表明，微量元素与人体的生物功能也有着密切关系[2]，微量元素在人体内含量虽然很少，但却是人体不可或缺的元素。

人体在生命活动的氧化代谢过程中会不断产生各种自由基，体内过多自由基对生物大分子造成损伤，导致细胞和组织的结构和功能减退，并对机体的衰老过程产生影响[3]，最终导致疾病的发生。而人工合成的抗氧化剂具有一定的毒性和致癌作用[4]。所以评价和筛选具有强抗氧化活性的天然植物己成为医学、生物学和食品科学研究的新趋势。

目前，猪牙花这种植物国内外均无研究。本实验对猪牙花乙醇提取物的抑菌活性及其抗氧化作用进行研究，并对微量元素含量进行测定，以期为其开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪牙花(Erythronium japonicum Decne.)采集于吉林省临江市老岭基地。样品经吉林农业大学园艺学院胡全德教授鉴定为猪牙花。

甲基紫、Tris缓冲溶液、H2O2溶液、FeSO4溶液、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硝酸(优级纯)、高氯酸(优级纯)等，其他试剂均为分析纯，测定与分析用水均为超纯水。

1.2 供试菌种

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均由吉林农业大学预防兽医学实验室提供。

1.3 仪器与设备

3510/3511型原子吸收分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；UV2300紫外分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；VELP凯氏定氮仪消化炉 Mitamura Riken Kogyo公司；百灵LA114型电子天平(110g/0.0001g) 常熟市百灵天平仪器有限公司；RE52-05旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 猪牙花乙醇提取液的制备

称取干燥猪牙花全草80g，粉碎，用10倍量80%乙醇浸泡12h，之后超声提取，超声时间30min，温度30℃，过滤，之后分别用8倍量、6倍量80%乙醇重复提取两次。合并滤液，减压浓缩成至100mL，60℃将部分溶液 蒸干成浸膏，另一部分溶液保存于0～4℃冰箱，备用。

1.4.2 猪牙花提取液抑菌实验

营养琼脂培养基的制备[5]：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、蒸馏水1000mL、琼脂20.0g、pH7.0。

滤纸片法测定最小抑菌质量浓度(MIC)[6-7]：将1.4.1节中的提取液用二倍稀释法进行稀释，质量浓度分别为800、400、200、100、50、12.5mg/mL。培养皿上分别接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌菌悬液各0.2mL(菌浓度106CFU/mL)，涂布均匀，然后将直径5mm的灭菌滤纸片在提取液中浸泡2h后贴在培养基上，每皿3片等距放置，每菌3份平行，另外，每个菌种用灭菌的滤纸片做一份空白对照及链霉素(100μg/mL)进行阳性对照，置培养箱中37℃条件下培养24h。用十字交叉法测量并记录抑菌圈的大小，结果取3次重复实验的平均值，得不同质量浓度提取物对供试菌的抑菌效果，抑菌圈不明显所对应的提取物浓度即为最低抑菌浓度。

抑菌活性对热稳定性测定[8]：用试管分装2mL 400mg/mL的提取液，分别置于40、60、80、100℃水浴处理30min，然后降至室温。以金黄色葡萄球菌为指示菌采用滤纸片法测定其抑菌效果。

抑菌活性对紫外光稳定性测定：将2mL 400mg/mL提取液分装于9cm培养皿中，置紫外灯365nm波长下分别照射5、15、30、45、60min，以金黄色葡萄球菌为指示菌采用滤纸片法测定其抑菌效果。

抑菌活性对酸碱稳定性测定：用0.1mol/L稀盐酸和稀氨水溶液将400mg/mL猪牙花提取液的pH值分别调至2、4、6、8、10，以金黄色葡萄球菌为指示菌采用滤纸片法测定其抑菌效果。

1.4.3 猪牙花提取物抗氧化实验

样品溶液的制备：精密称取1.4.1节中猪牙花浸膏0.25g置于50mL具塞容量瓶中，加入适量的蒸馏水，密封超声30min，待其溶解完全后，定容至刻度，得到样品母溶液，备用。在样品母溶液中，用移液枪精密移取体积为5、10、20、40、80、160、320、640μL的样品母液，用蒸馏水定容于10mL容量瓶中得到质量浓度为0.0025、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg/mL的样品溶液。

试剂的制备：称取0.2032g甲基紫用去离子水定容于100mL容量瓶中，备用。用盐酸调Tris缓冲溶液pH值为3.5，备用。取体积分数30%的H2O2溶液1.0mL，用去离子水定容于100mL容量瓶中，备用。称取0.0695g FeSO4·7H2O 用水定容于50mL容量瓶中，备用(现用现配)。

羟自由基(·OH)的产生及测定：取配制好的甲基紫溶液2mL，Tris缓冲液1mL，按顺序放入10mL的刻度管中。并用去离子水定容至刻度，摇匀静置30min，测定吸光度A578nm。取配制好的甲基紫溶液2mL，Tris缓冲液1mL，Fe2+溶液1mL，H2O2溶液1mL按顺序放入10mL的刻度管中。并用去离子水定容至刻度，摇匀静置30min，测定吸光度记为A0。取配制好的甲基紫溶

液2mL，Tris缓冲液1mL，不同浓度梯度的待测液2mL，Fe2+溶液1mL，H2O2溶液1mL按顺序放入10mL的刻度管中。并用去离子水定容至刻度，摇匀静置30min。平行3次，测定吸光度记为As。

利用SPSS 16.0软件分析，得出50%抑制浓度(IC50值)。

1.4.4 微量元素的含量测定

样品处理：精密称取猪牙花样品2.0000g于凯氏瓶内，3份平行，取20mL事先配好的HNO3-HClO4溶液分别加到瓶内，密封过夜。加热消化，至溶液呈白色近干为止。冷却后，定容至50mL，混匀备用。同法制备空白溶液。测定仪器为原子吸收分光光度计，附80586微机和FAAS软件，工作条件见表1。

表1 原子吸收分光光度计工作条件表Table 1 Working conditions of atomic absorption spectrophotometer

微量元素校准曲线：4种元素的标准溶液，均由标准储备溶液稀释而得，分别加入标准溶液，以配成不同浓度的标准系列，计算出回归方程和相关系数，见表2。各元素回收率在99.60%～102.53%之间，能满足实验的要求。

表2 微量元素回归方程与相关系数Table 2 Regression equations and their correlation coefficients for trace element determination

2 结果与分析

2.1 猪牙花提取液抑菌实验

2.1.1 最小抑菌质量浓度(MIC)的测定

由表3可知，猪牙花提取液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度为12.5mg/mL，对沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌质量浓度均为100mg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为200mg/mL。

表3 猪牙花提取液对4种细菌的抑菌作用Table 3 Antibacterial activities of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne against four common bacteria

2.1.2 热处理对猪牙花提取液抑菌活性的影响

图1 热处理对猪牙花提取液抑菌活性的影响Fig.1 Effect of thermal treatment on the anti-Staphylococcus aureus of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne

由图1可知，猪牙花提取物具有良好的热稳定性，即使经高温100℃处理后，仍具有较高的抑菌活性。

2.1.3 紫外光对猪牙花提取液抑菌活性的影响

图2 紫外光对猪牙花提取液抑菌活性的影响Fig.2 Effect of ultraviolet irradiation on the anti-Staphylococcus aureus of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne

由图2可知，猪牙花提取物在紫外光照射的条件下，抑菌活性基本稳定，在紫外光照射60min时仍有较强的抑制效果。

2.1.4 不同pH值对猪牙花提取液抑菌活性的影响

图3 pH值对猪牙花提取物抑菌活性的影响Fig.3 Effect of pH on the anti-Staphylococcus aureus of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne

由图3可知，猪牙花提取物条件稳定，pH10时其抑菌效果最好。

实验结果表明，猪牙花对金黄色葡萄球菌等4种常见致病菌及食品腐败菌具有良好的抑菌效果，4种供试菌的抑制效果依次为：金黄色葡萄球菌＞沙门氏菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌。猪牙花提取液对金黄色葡萄球菌的抑制效果最好，最小抑菌质量浓度为12.5mg/mL。猪牙花提取物经高温100℃处理后，仍具有较高的抑菌活性，说明其具有良好的耐热性。经紫外光照射60min、pH4～10仍具有稳定的抑菌活性，可见其对高温、紫外照射和酸性条件下都有良好的稳定性，可将提取液加入到食品中，提高加工食品的保存性。

2.2 猪牙花提取液的抗氧化实验

表4 不同质量浓度猪牙花提取物清除羟自由基结果Table 4 Hydroxyl free radical scavenging effects of the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne at different concentrations

由表4可知，随着猪牙花提取液质量浓度的增加，对羟自由基清除呈明显的量效关系，猪牙花提取液在0.0025～0.32mg/mL的质量浓度范围内，其清除率达到64.57%。

由此得出猪牙花根提取物(IC50)为0.051mg/mL。这说明猪牙花乙醇提取物对羟自由基有很强的清除作用。为开发天然抗氧化药品、治疗因人体内自由基过多而产生的疾病提供了有力的依据。

2.3 猪牙花提取物微量元素含量

由表5可知，猪牙花的微量元素含量很高，其中Fe的含量为最高，已达633.25μg/g，其他含量高低顺序依次为Zn＞Mn＞Cu。

表5 猪牙花提取物微量元素含量测定结果Table 5 Results of determination of trace elements in the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne

3 讨论与结论

有资料显示鱼腥草中抑菌的有效成分为鱼腥草素，具有抗菌、抗病毒、利尿、抗炎镇痛等作用，可用于呼吸道感染等疾病，其对金黄色葡萄球菌的MIC为31.3mg/mL[8]，对比可知，猪牙花对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更强，可见其在针对于金黄色葡萄球菌的抗菌剂市场具有广阔的开发前景。

由于微量元素与人体健康及寿命有关，这4种元素对人体有直接的影响，参与许多新陈代谢的过程，锌铜比值与心血管疾病、动脉粥样硬化和高血压的发病机率呈正相关性[9-11]。正常人的比值在10.5～16.5之间，患者体内的比值在12.5～18.5之间[9]，猪牙花中锌铜比值为3.33，可降低患者体内的比值。

猪牙花提取物IC50值为0.051mg/mL，表明该提取物有很强的抗氧化作用，这可能于该植物中含有某种化学成分有关，有待深一步研究。

综上所述，本实验对猪牙花的微量元素含量测定，抑菌活性及抗氧化作用的研究表明，猪牙花乙醇提取物有很强的抑菌效果，清除羟自由基能力较强，而且猪牙花微量元素的含量很高。另一方面，猪牙花这种物质资源丰富、分布广泛，有很大的发展潜力，这对于研究猪牙花提取物在食品及医药行业的应用具有重要的意义，有望开发成为天然防腐剂及药物。

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Antibacterial and Hydroxyl Radical Scavenging Activities and Trace Element Determination of Ethanol Extract from Erythronium japonicum Decne

CAI En-bo，ZHAO Yan，YANG Zhi-hui，TIAN Yang，CHEN Hong-mei，GAO Yu，WU Qian，ZHENG You-lan*
(College of Chinese Medicinal Material, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To evaluate whether the ethanol extract from Erythronium japonicum Decne has antibacterial activity and the ability to scavenge hydroxyl radicals and determine its trace elements. Methods: The antibacterial activity of the ethanol extract against four common bacteria was assessed by measuring its minimal inhibitory concentrations (MIC) by filter paper method and the effects of temperature, pH and UV irradiation on its antibacterial activity were dealt with. Trace elements such as iron, magnesium, zinc and copper were determined using atomic absorption spectrophotometry. Experimental results were subjected to statistical analysis using SPSS16.0. Results: The MICs of the ethanol extract were 12.5, 100, 100 mg/mL and 200 mg/mL for Staphylococcus aureus, Salmonella, Bacillus subtilis and Escherichia coli, respectively. Thermal treatment, acidic environment and UV irradiation had no obvious effect on the antibacterial activity of the ethanol extract. The contents of iron, magnesium, zinc and copper of the ethanol extract were 633.25, 30.45, 39.95μg/g and 12μg/g, respectively. Conclusion: Erythronium japonicum Decne contains high levels of trace elements and exhibits excellent antibacterial and hydroxyl radical scavenging activities. Thus, this herb has a high exploitation value.

Erythronium japonicum Decne；antibacterial activity；hydroxyl radical scavenging activity；trace elements

R931.71

A

1002-6630(2010)17-0060-04

2010-01-06

蔡恩博(1982—)，男，硕士研究生，主要从事天然产物化学成分研究。E-mail：caienbo8251@163.com

*通信作者：郑友兰(1956—)，女，教授，主要从事新药研究与开发。E-mail：zcx_11@126.com