直链淀粉含量测定方法研究进展

杨有仙，赵 燕，李建科,*，黄新球

(1.南昌大学 生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

直链淀粉含量测定方法研究进展

杨有仙1,2，赵 燕1,2，李建科1,2,*，黄新球2

(1.南昌大学 生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047；2.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

基于直链淀粉含量对粮食品质和淀粉的合理加工、利用具有重要意义，对直链淀粉含量测定方法进行系统、全面的研究很有必要。本文对直链淀粉含量测定的现行标准方法、常用方法及近年来报道的新方法进行系统的介绍和评述，便于在选择测定方法时提供参考。

直链淀粉含量；测定方法；标准方法；

天然淀粉(native starch)由直链淀粉(amylose，Am)和支链淀粉(amylopection，Ap)两大主要成分组成，直链淀粉和支链淀粉的分子结构、相对分子质量和理化特性等有很大差异。直链淀粉是D-葡萄糖残基以α-l,4-糖苷键连接形成的长链葡聚糖，通常由200～900个葡萄糖残基组成，相对分子质量为3.2×104～1.6×105，甚至更大，直链淀粉链上有一个还原性端基和一个非还原性端基[1]。直链淀粉通过分子内氢键的相互作用，使分子链卷曲成螺旋形的构象存在，每一圈螺旋有6个葡萄糖单元，螺旋形构象又在分子链上各极性基因的相互作用下再发生弯曲与折叠[2]。张革新等[3]用分子力学以及分子动力学方法得到的直链淀粉优化模型是一条螺旋长链，证明文献报道的螺旋形结构与实际相符合。

支链淀粉由线型直链淀粉短链组成，且具有高度分支结构，约20个葡萄糖单元一个分支，分支处由α-l, 6-糖苷键连接形成树枝状。支链淀粉分子比直链淀粉分子大很多，其相对分子质量约在几百万到几亿之间，分子中有多个非还原性末端，但只有一个还原性末端。从不同农作物中得到的淀粉，其直链淀粉和支链淀粉的组成含量、比例及其分子质量、分子结构等并不相同。

1 研究直链淀粉含量的意义

直链淀粉含量是影响粮食感官品质和加工特性的一个重要因素，其含量的高低，可作为评价粮食品质的一个重要指标。此外，淀粉的糊化、凝胶化、黏稠度、溶解度、膨胀能力、消化性和抗性等性质也与直链淀粉含量密切相关[4]。所以，直链淀粉含量对粮食的合理加工，淀粉的合理利用，农业选种、育种均具有重要意义。

直链淀粉用途广泛，涉及食品、医疗保健、材料、纺织、造纸、包装、环保等多个领域，如直链淀粉可用作食品添加剂、增厚剂、固定剂和包衣剂，

还可用于制作对氧和油脂具有良好隔绝性的产品保护层等[5]，当然直链淀粉易引起回生，但是可以通过对直链淀粉进行化学改性的方式来减缓和抑制回生进程，提高其利用价值。用高直链淀粉制作的食品对糖尿病和结肠癌具有预防和辅助治疗效果，它还具有防止胆结石形成及降低胆固醇的作用，在肥胖食品中也具有很重要的应用价值[6]。高直链淀粉是制造生物可降解塑料的最佳原料[7]，因为其具有原料来源广泛、价格低廉、性能优越和易生物降解等优点，对于解决目前日益严重的白色污染和石油资源匮乏是一条很有效的途径[8]。总之，由于直链淀粉具有特殊的分子结构和理化性质，还有独特的营养功能、消化特性和加工性能，将会具有更加广泛的应用前景。

基于直链淀粉具有优越的性能和广泛的应用前景，且其含量在评价粮食品质和农业选种、育种时具有实际意义，因此对直链淀粉含量测定方法进行系统、全面的研究很有必要。

目前，除了传统的碘比色法和碘亲和力滴定法测定直链淀粉含量，近年来报道较多的新方法有色谱分析法、近红外光谱分析法、自动分析检测法、伴刀豆球蛋白法等，各种方法各有其优缺点和适用性。本文对直链淀粉含量测定的现行标准方法、常用方法、近年来报道的新方法进行介绍和评述，旨为人们在选择测定方法时提供参考，便于针对不同类型的淀粉、不同的用途、不同的要求，选择一种准确、有效、简便的方法。

2 直链淀粉含量测定方法

2.1 标准方法

直链淀粉含量测定的主要方法是由Wi11iams等[9]提出的碘比色法，原理是根据碘与直链淀粉作用产生蓝色，与支链淀粉作用产生红紫色，而淀粉则随两种组分含量的不同而呈现不同程度的蓝紫色，用比色法可测出样品中两种组分的含量，其操作过程比较复杂，费时。后来Juliano等[10]对该方法进行了改进，使测定时间简化到几个小时，目前国内外普遍采用这种方法作为标准方法。这种方法的优点是技术成熟，易操作，对仪器设备要求不高，因此被广泛采用。此法在实验室测定样品数目相对较少的情况下还是可行的，但因为技术性强、操作复杂、耗费时间，无法实施有效、快捷的准确检测，对大批量样品检测相当困难。以下对现行的标准方法进行介绍和比较。

2.1.1 国家标准

国家标准GB/T 15683——2008《大米直链淀粉含量的测定》[11]等同采用ISO 6647-1—2007《稻米直链淀粉含量测定 第1部分 推荐方法》(英文版)，该标准代替了GB/T 15683—1995《稻米直链淀粉含量的测定》。GB/T 15683—2008规定了非熟化大米直链淀粉含量的测定方法——基准方法，适用于直链淀粉含量高于5%(质量分数)的大米。此法操作步骤繁琐，需要测试人员具备良好的实验技能和熟练的操作技巧。

2.1.2 国际标准

国际标准ISO 6647-2—2007《稻米直链淀粉含量测定 第2部分 常规方法》[12]是ISO 6647-1—2007《稻米直链淀粉含量测定 第1部分 推荐方法》的简化法。与ISO 6647-1—2007相比，主要有以下不同：待测样品不用进行脱脂处理，省去了较长的静置时间，标准曲线绘制采用已知直链淀粉含量的未脱脂标准样品。此法可缩短检测时间，简便检测过程。

2.1.3 农业部标准

农业部标准NY/T 83—1988《米质测定方法》[13]中有两种测定直链淀粉含量的方法：1)按国标法NY/T 55—1987《水稻、玉米、谷子籽粒直链淀粉测定法》[14]进行测定；2)改进简化法：该方法也要经过与NY/T 55—1987相同的样品分散步骤，但省略了石油醚脱脂的操作，并在标准曲线绘制中采用与待测样品保存在同样条件下的已知直链淀粉含量的未脱脂标准样品。

表1 4种标准方法具体步骤比较Table 1 A comparison of four standard methods

表1列出了4种直链淀粉含量测定标准方法的主要区别。各种方法间的区别主要表现在脱脂处理、脱脂后静置时间和使用的标准样品等方面。当试样与标样的脱脂处理情况一致时，所得结果与实际值的误差在标准允许误差范围内。如ISO 6647-2—2007和NY/T 83—1988改进简化法省去了脱脂处理步骤，而采用未脱脂标准样品绘制标准曲线，使得检测结果得到补偿，有一定的可行性，可达到与进行脱脂处理方法同样准确、可靠的精度。应该注意的是：上述标准方法主要是针对于稻米中的直链淀粉含量测定而言的，对于其他种类淀粉的测定延伸范围并不明确，因此，如果待测定的淀粉种类改变后标准方法并不可取。另外，国标法根据直、支链淀粉标准品不同的混合比例来计算样品中直链淀粉

的含量，但当样品与标准品比例不相符合时，就会产生测量误差。再者，国标法所配的标准系列溶液是在平均淀粉含量为90%的大米干基基础上计算所得，而一般情况下对所测的样品平均淀粉含量并不明确，因此按这个假设来计算，必定会产生测量误差。而且ISO 6647-2—2007和NY/T 83—1988改进简化法的标准系列是已知直链淀粉含量的未脱脂标准样品，其所给出的直链淀粉含量本身就存在误差，因此所测得的样品直链淀粉含量也只能是一个粗略值，不适宜精确测定[15]。

2.2 常用方法

前面介绍的几种标准方法由于在使用中有一定的限制，前处理较麻烦、操作步骤较繁锁、技术性较强等原因，因此在实际应用中有较大的局限性。目前，应用较为广泛的是碘亲和力滴定法和双波长法，近年来有很多文献报道将其用于小麦[16-17]、薯类[18]、板栗[19-20]、高粱[21]、葛根[22]和豆类[23]等不同农作物中直链淀粉含量的测定。

2.2.1 碘亲和力滴定法

碘亲和力滴定法原理：当淀粉溶液用碘进行电位滴定时，在碘与淀粉形成络合物期间没有电学性质(电流、电压)变化，但一旦有游离碘存在即产生电位(或电流)，并可看到电位(或电流)的变化，因而可从电位(或电流)滴定曲线求出形成络合物的碘量，计算相当于碘结合量的淀粉量。具体测定方法有电位滴定法和电流滴定法，这两种方法都要先用纯直链淀粉和支链淀粉，绘制出电位(或电流)滴定曲线，然后用样品滴定，最后根据滴定数值求出样品中直链淀粉和支链淀粉的含量。碘亲和力会随着淀粉的来源不同而不同，每一种淀粉都有其特定的碘亲和力值，其值的大小主要取决于淀粉中直链淀粉的含量，直链淀粉含量越高，碘亲和力值也越大，所以常用碘亲和力来确定淀粉中直链淀粉的含量[24]及作为评定直链淀粉纯度的一项指标[25]。

曹忙选[16]用电位滴定法制作出标准工作曲线，再根据淀粉样品滴定终点消耗的碘酸钾(KIO3)的体积直接查出直链淀粉的百分含量，结果表明该方法简便、快速、准确，适合对大批量样品(如育种、品种普查等)的测定。

陈俊芳等[19]对碘比色法和电位滴定法进行了比较，认为电位滴定法的标准工作曲线是由多个函数拟合的方法绘制成的，与比色法相比，更加科学合理、精确可靠，而且其直线回归方程相关系数更加接近 l，测得的结果更稳定、重复性更高，是测定直链淀粉含量的一种科学、合理、有效的方法。

2.2.2 双波长法

因为支链淀粉也会与碘形成络合物，这种络合物会和直链淀粉-碘复合物吸收相同波长的光，从而导致所测定的直链淀粉含量比真实值要高。另外，单波长法只能测定谷物中直链淀粉含量，而粮食的食味品质还与支链淀粉的含量及直链淀粉和支链淀粉的比例有关。运用双波长法可以同时获得直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量3个指标，省时又省力，工作效率高，适用于大批量分析[26]。

双波长比色法原理：如果溶液中某溶质在两个波长处均有吸收，则两个波长的吸光度差值与溶质浓度成正比。用与待测样品相应的标准品配制的直链淀粉和支链淀粉的标准溶液分别与碘反应，然后在同一个坐标系里进行扫描(400～960nm)或作吸收曲线，作图确定直链淀粉的测定波长和参比波长λ2、λ1，支链淀粉的测定波长和参比波长λ4、λ3。再将待测样品与碘显色，在选定的波长处作4次比色，然后利用直链淀粉和支链淀粉标准曲线即可分别求出样品中两类淀粉的含量。因测定的是试样在两波长处的吸光度差值，扣除了两类淀粉吸收背景的相互影响，故可提高测定的灵敏度和选择性。

戴双等[27]通过单波长法和双波长法对小麦直、支链淀粉含量测定进行了比较，结果表明，双波长法可以有效地排除其他物质的干扰，测定结果优于单波长法。范明顺等[21]采用双波长法得到的直链淀粉的回收率为95.0%～101.7%，支链淀粉的回收率为98.8%～103.2%，表明双波长法测定的结果重现性较好，相对标准偏差小于1%。

2.3 新方法

虽然国内外在直链淀粉含量测定方面制定了标准方法，但是因为标准方法技术性强、操作复杂、耗费时间，无法实施有效、快捷的准确检测。因此对于大批量样品检测，如何提高其分析检测速度也就越来越受关注。近年发展起来的直链淀粉含量测定新方法有：近红外光谱分析法、自动分析检测法、色谱分析法和伴刀豆球蛋白法。

2.3.1 近红外光谱分析法

传统方法在检测直链淀粉含量时，待测样本需要进行出糙、精白、粉碎等一系列破坏性的前处理，经过处理后的样品不能继续种植，而且操作步骤繁琐，测试速度慢，不适于对样品进行批量分析、筛选育种早代材料。近红外光谱分析法(NIRS)是近年来兴起来的一种新的定量分析技术，具有样品用量少、方便、快速、高效、准确，不消耗化学试剂，不污染环境，不破坏样品，可以一次扫描进行多项检测等优点。其原理是利用有机化合物在近红外区具有特征吸收，利用这一性质进行样品中有机化学成分的快速定量分析。

陆艳婷等[28]用近红外光谱分析法对大批量的粳稻稻谷、糙米、精米、糙米粉和精米粉等样品进行了分析，其所得结果既能满足粳稻品种低代选择小样本、无损伤测定的需要，也能满足高代大批量样本的测定，且近

红外分析结果与化学法测定值有高度的相关性。Fertig等[29]研究了用近红外光谱技术测定直链淀粉含量的效果，所得样品直链淀粉含量与供应商所提供的数据有较好的相关性，且其快速、微量、无损性检测很适合大批量育种分析，具有常规化学分析方法无可比拟的优越性。彭建等[30]用化学法和近红外仪器法对小麦籽粒直链淀粉含量进行预测，说明两种方法测试淀粉和直链淀粉含量的结果均无显著差异，近红外品质分析仪测定的结果是准确可靠的。

近红外光谱分析法作为一种快速非破坏性的直链淀粉含量的检测技术，在农作物品质育种实践和粮食加工企业的品质监控上，将具有广阔的应用前景。但是近红外光谱分析仪器价格较为昂贵，不能得到广泛应用。另外，近红外光谱分析结果的准确性与定标模型建立的质量和模型的合理使用有很大关系，为最大限度地涵盖待测未知样品成分的范围，需要尽可能多地收集样品，需要耗费较大的人力物力，且不能用于直链淀粉含量的精确测定和特殊材料(直链淀粉含量很低或很高的材料)的评价，不适合作为样品和所测项目经常变化的分散性样品检测的手段[31]。

2.3.2 自动分析检测法

自动分析检测法测定直链淀粉含量的原理与传统的碘比色法原理是一样的，主要采用以碘比色法原理为基础的各种自动分析仪代替了人工进行检测和计算[32]。该法为农作物品质鉴定及遗传分析提供一种精确、智能化、自动化的微量分析方法。如FUTURA全自动连续流动分析仪配有自动进样器，可一次性进行多达240个样本的连续分析，检测结果由分析软件自动计算，1个样本的检测时间仅需要90s[33]。将其用于直链淀粉含量的检测，简化了国标法等繁琐的操作过程，降低了检测人员操作技术对测试结果的影响程度，提高了工作效率，降低了分析人员的工作强度，省去了分光光度计下的比色和数据计算过程，减少了试剂和试样的消耗量，实现了显色、比色和数据处理同时进行，同时避免了微量测试时定容比色难于操作和不能进行平行测试的缺点，可减少操作误差，提高测试准确度，是一种快速、准确，重现性好的测定稻米直链淀粉含量的较理想方法。用于大批量样本和样本量非常少的珍稀样本测定，更显示了常规法无法比拟的优越性，为直链淀粉含量测定研究提供了便利技术。

刘卫国等[34]采用国标法和流动分析法测定了稻米中直链淀粉的含量，通过两种方法的重复性比较表明：两种方法测定结果的平均标准偏差为0.1077，变异系数为0.61% ，测得的直链淀粉含量无显著性差异，均能得到准确的结果。且流动分析法的平均标准偏差和平均变异系数分别为0.0821和0.49%，国标法的分别为0.1119和0.64%。说明用流动分析仪测定直链淀粉含量可完全满足国标要求，而且连续流动分析法与国标法相比具有更好的重复性。

倪小英等[35]用SKALAR化学自动分析仪测定稻米中的直链淀粉，该法每分析一个样品只需要5min，回收率为98.75%～104.70%，所测标样及样品的相对标准偏差达到0.4%～3.2%，表明此法分析速度快、准确度高、重复性好。另外操作简单，可减少人为因素造成的误差，批量检测时，可大幅度减少试剂和试样的消耗量也是其显著优点。由此可见，自动分析检测法不仅可以极大地提高工作效率，降低分析人员的工作强度，减少人为误差，而且分析结果和传统方法的分析结果无差异，适合于大批量直链淀粉含量的分析检测。然而该分析仪的价格比较昂贵，而且须经常更换塑胶药管等零配件，因此该方法得到推广应用还需要一定的时间。

2.3.3 伴刀豆球蛋白法

目前常用的测定直链淀粉含量的方法都是利用直链淀粉与碘可以形成络合物的性质，由于支链淀粉也可以与碘形成络合物，因此在非比色法测定中会降低游离碘的浓度；在比色法测定中，这种络合物会和直链淀粉-碘复合物吸收相同波长的光，从而导致测得的直链淀粉含量偏高，需要进行校正。另外，直链淀粉-碘络合物的最大吸收波长随聚合度的增加而增加，因此不适合于测定不同植物来源的淀粉样品。

而伴刀豆球蛋白法不存在不确定性问题，测定结果准确性高，可适应于不同植物来源的淀粉样品，不需要使用直链淀粉、支链淀粉校准曲线，同时还可测出总淀粉含量，另外它也可直接用于谷物面粉中直链淀粉含量的测定，而不需要预先的淀粉纯化过程。

伴刀豆球蛋白法的原理是根据伴刀豆球蛋白(Con A)能够与多个非还原性末端基团上的α-D-吡喃葡萄糖基或α-D-吡喃甘露糖基单位特异性结合，由于多分支的支链淀粉链中有大量非还原性端基的α-D-葡萄糖残基，因此Con A可在指定的pH值、温度和离子强度下，与淀粉中的支链淀粉成分特定的结合并生成沉淀，但是不能结合以线性为主的直链淀粉成分[36]。离心去除沉淀，取单位体积上清液，把其中的直链淀粉用酶水解为D-葡萄糖，然后用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂(GOPOD)进行测定，根据Con A沉淀样品的上清液和与总淀粉样品中的GOPOD在波长510nm处的吸光度之比判断直链淀粉在总淀粉中的含量[37]。基于此法，爱尔兰Megazyme公司已经有商品化的试剂盒出售，使直链淀粉含量检测更方便、快捷、准确。

2.3.4 排阻色谱分析法

排阻色谱法(SEC)又称尺寸排阻色谱或凝胶渗透色谱

法。其原理比较特殊，类似于分子筛，待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子质量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子质量差异对各组分的分离。近几年，凝胶渗透色谱越来越多用于对直链淀粉和支链淀粉的纯度鉴定，其在直链淀粉和支链淀粉的定量分析中近年来也有应用[38]。

天然淀粉主要由直链淀粉、中间级分和支链淀粉组成，其中直链淀粉的相对分子质量最小，一般在几万到几百万之间，支链淀粉的相对分子质量最大，约在几百万到几亿之间，中间级分是介于直链淀粉和支链淀粉之间的多糖成分[39]。将淀粉样品通过凝胶排阻色谱，得到的排阻色谱图可能具有1～3个峰，代表直链淀粉、中间级分和支链淀粉，根据分子排阻色谱图可计算出淀粉样品中直链淀粉的含量。Gerard 等[40]利用SEC进行了直链淀粉含量测定。其基本操作过程：先将淀粉样品溶于二甲基亚砜(DMSO)充分分散，再通过5μm微孔过滤器过滤后，上TSK HW75 S凝胶(Toso Haas，德国)柱。然后进行洗脱，每隔18min收集洗脱液。洗脱液采用淀粉葡萄糖酶法测定总碳水化合物含量，并测定其与碘形成的络合物的最大吸收波长(λmax)。得到的淀粉样品排阻色谱图有3个峰，第一个峰是支链淀粉，第二个峰是中间级分，第三个峰是直链淀粉。通过对比峰面积可计算出直链淀粉的百分含量。Grant等[41]用高效排阻色谱法对直链淀粉含量进行了研究，得到的色谱图具有两个峰，为直链淀粉和支链淀粉，根据峰面积可得到直链淀粉的百分含量。Charoenkul等[42]采用用荧光标记和高效排阻色谱法对木薯直链淀粉含量和支链淀粉链长同时进行了研究，通过折射率(RI)反应检测显示得到的色谱图表明：直链淀粉和支链淀粉组分峰完全分离，重复性分析的标准偏差小于0.6%，分析重现性较好。

该法可同时进行直链淀粉和支链淀粉含量、分子质量的检测，工作效率高，结果准确可靠，而且因其不需要其他腐蚀性溶液来溶解淀粉，安全性较高。

3 结 语

在以上介绍的方法中，大多数都和直、支链淀粉标准品有密切关系，而事实上在测定过程中，标准品的来源不同测定结果是有很大差别的。如测定马铃薯淀粉中直链淀粉含量，就要用马铃薯直链淀粉标准品，如用玉米的就会有很大偏差。因此，在进行直链淀粉含量测定时，要考虑待测淀粉的来源以及标准品的来源、提取方式和纯度，选择与待测样品相应的标准品。此外，几种标准方法主要还是针对于稻米淀粉而言的，对于其余来源的淀粉，目前还没有统一的标准，有待于进一步研究完善。然而，几种新方法因操作复杂，仪器、试剂价格高而难于推广应用。当然，每种方法都不是完美无缺的，都有其优缺点和适用性，因此，在选择直链淀粉含量的测定方法时应注意以下几个方面：1)淀粉的来源和用途；2)测定所要求的灵敏度和精确度；3)试样中存在的干扰因素；4)所需要的投入，包括仪器、材料、药品和时间等。综合考虑各方面因素，针对不同类型的淀粉、不同的用途、不同的要求，选择一种准确、有效、简便的方法。

相信随着现代分析检测技术的进一步发展，将会有更多的分析方法和新型技术应用到直链淀粉含量的测定研究中，为广大工作者提供更为快速、准确、高效和适用性广的测定方法。

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Research Progress in Determination Methods for Amylose Content

YANG You-xian1,2，ZHAO Yan1,2，LI Jian-ke1,2,*，HUANG Xin-qiu2
(1. Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Based on the significance of amylose content to the quality of grain as well as the processing and utilization of starch, systematic and comprehensive studying of the methodology for the content determinination in amylose is necessary. This article systematically introduces standard methods, commonly used methods and newly emerging methods reported in recent years. This may provide useful

for the choice of an appropriate method for the determination of amylose content according to the actual requirements.

amylose content；determination method；standard method

TS232

A

1002-6630(2010)23-0417-06

2010-09-23

江西省科技厅项目(2007BN11800)

杨有仙(1987—），女，硕士研究生，研究方向为可降解塑料的开发与利用。E-mail：yangyouxian47@163.com

*通信作者：李建科(1962—)，男，教授，博士，研究方向为食品科学、化学工程与生物质转化。E-mail：jianke_li@yahoo.com