黄伞子实体多糖的初步纯化及降血脂研究

李德海，王志强，孙常雁，王 萍,*

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省乳品工业技术开发中心，黑龙江 哈尔滨 150086)

黄伞子实体多糖的初步纯化及降血脂研究

李德海1，王志强1，孙常雁2，王 萍1,*

(1.东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省乳品工业技术开发中心，黑龙江 哈尔滨 150086)

目的：探讨黄伞子实体多糖的纯化方法及对高脂血症小鼠降血脂作用。方法：子实体多糖经中性蛋白酶和Sevag法联合除蛋白，用高脂饲料建立高脂血症模型，给药高、中、低剂量组分别为400、200、100mg/(kg bw·d)，5周后测定小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。结果：黄伞子实体多糖能显著降低TC(高、低剂量组P＜0.05)、TG(中剂量组P＜0.05，低、高剂量组P＜0.01)、LDL-C(中、高剂量组P＜0.05，低剂量组P＜0.01)水平，提高HDL-C水平(低、高剂量组P＜0.05，中剂量组P＜0.01)和动脉粥样硬化因子(AI)(高剂量组P＜0.05)。结论：黄伞子实体多糖具有降低小鼠高血脂症、预防动脉粥样硬化的作用。

黄伞；多糖；高脂血症；降血脂；小鼠

高血压、动脉粥样硬化以及冠心病是常见的心血管疾病，血脂升高是形成动脉粥样硬化的危险因素之一。因此降低血脂含量对预防高血压、冠心病等心血管疾病具有重要意义。研究表明，食用菌多糖中某些成分可以降低血栓物质的形成；一些食用菌多糖中含有特种氨基酸，可帮助脂类物质的降解[1]。

黄伞(Pholiota adipose (Fr) Quel)属真菌门、担子菌纲，又名肥鳞伞、柳蘑等[2]。黄伞色泽金黄，营养丰富，子实体中粗蛋白、粗纤维和灰分的含量与一般食用菌的含量相当，粗脂肪含量低于一般食用菌，多糖含量为4.11%，高于一般食用菌[3]。许多研究证明其多糖具有抗肿瘤、抗疲劳、抗微生物活性等生物理能[4-6]，

因此引起了人们越来越多的关注。

黄伞营养保健价值高，但国内对黄伞的研究起步较晚，且主要停留在对黄伞的野生驯化、生物学特性及人工栽培技术等方面[7-9]。目前关于黄伞多糖生物活性的研究很少，关于应用黄伞子实体多糖降血脂功能的研究还未见报道，本研究通过高脂饲料建立小鼠高脂血脂模型，探讨黄伞子实体多糖的降血脂作用，为进一步研究多糖降血脂作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄伞子实体由东北林业大学林学院森林保护专业实验室提供。

年幼纯系昆明种小鼠(由黑龙江省医学实验动物基地提供)，雄性，体质量(20±2)g；基础饲料由哈尔滨医科大学提供。

猪油 自制；胆固醇 天津市光复精细化工研究所；猪胆盐 天津虔诚伟业科技发展有限公司；血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 温州东欧津玛生物科技有限公司；甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C) 北京北化康泰临床试剂有限公司。1.2仪器与设备

TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；CHRIST 1-2真空泠冻干燥机 德国Christ公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；LD4-2A低速离心机 北京医用离心机厂。

1.3 方法

1.3.1 黄伞子实体多糖的提取

黄伞子实体经粉碎过60目筛，醇沉过夜除去小分子多糖。在料液比1∶20、提取时间2h、提取温度90℃的条件下提取黄伞子实体多糖提取液[10]，残渣在上述条件下进行第2次提取，合并两次提取液，在60℃旋转蒸发至原体积的1/4，浓缩后冷却至室温，加入3倍体积的90%乙醇溶液，醇沉过夜。于4000r/min离心10min，弃去上清液。沉淀物经冻干得黄伞粗多糖。

1.3.2 黄伞子实体粗多糖的初步纯化

1.3.2.1 Sevag法

取黄伞粗多糖2g溶于尽量少的蒸馏水中，与氯仿-正丁醇(4∶1)等体积混合并充分搅拌30min，除去游离蛋白质。醇沉过夜，离心，用有机溶剂洗涤沉淀，洗涤顺序：丙酮、乙醚、无水乙醇。沉淀冻干得黄伞子实体多糖，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

1.3.2.2 中性蛋白酶+Sevag法

取黄伞粗多糖2g溶于尽量少的蒸馏水中，按黄伞多糖质量的2%加入中性蛋白酶[11]，在50℃、pH7.0的条件下酶解2h，然后在80℃灭酶10min。其余步骤同1.3.2.1节。

1.3.3 高血脂症的建立

小鼠除空白组外其余以高脂饲料(猪油体积分数10%、胆固醇体积分数1%、猪胆盐体积分数0.3%、基础饲料体积分数88.7%)喂养诱导高血脂症的形成。3周后，随机从空白组和高脂组选取3只，摘眼球取血测定TC水平，以确定高脂模型的建立[12-14]。

1.3.4 降血脂实验

将已建立高血脂症的小鼠随机分为模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组1 0只，除空白组外其余各组饲喂高脂饲料，自由进食。各组给药剂量分别为：高剂量组(400mg/(kg b w·d))；中剂量组(200mg/(kg bw·d))；低剂量组(100mg/(kg bw·d))；空白组和模型组灌胃相等剂量的生理盐水。5周后禁食24h，摘眼球取血清测定TC、TG、HDL-C、LDL-C、血清抗动脉粥样因子AI(HDL-C/TC)水平[15]。

1.3.5 统计分析

利用SPSS统计软件对数据进行分析，结果以平均值±标准差表示，显著性水平确定为0.05，极显著性水平确定为0.01。

2 结果与分析

2.1 黄伞子实体多糖的初步纯化

黄伞粗多糖经过Sevag法除蛋白后多糖纯度为28.17%，而中性蛋白酶与Sevag法联合除蛋白得到的多糖纯度为72.88%，比仅用Sevag法提高44.71%。在纯化过程中，蛋白酶对黄伞子实体中的蛋白以及与多糖结合的蛋白进行水解，使多糖游离出来，同时蛋白被降解，增加了蛋白质的溶解性，从而有利于多糖和蛋白的分离，因此提高了多糖的纯度。

2.2 高脂模型组的建立

用高脂饲料喂养小鼠3周，测得小鼠体质量与TC变化。

表1 小鼠体质量和总胆固醇浓度变化Table 1 Changes in body weight and total cholesterol of mice

由表1可知，小鼠喂养3周后，小鼠体质量发生极显著性变化(P＜0.01)，3周后模型组小鼠体质量比空

白组小鼠体质量高出30%；小鼠血清总胆固醇含量极显著升高(P＜0.01)，升高率为82.2%，表明已建立高脂血症小鼠模型。本实验通过饲喂高脂饲料的方法建立高脂血症小鼠模型，其原理是胆固醇在代谢中产生胆酸，并参与脂肪的消化吸收，而猪胆盐能促进胆固醇在体内的代谢，从而加速高血脂症的形成

2.3 黄伞子实体多糖对小鼠体质量的影响

条码扫描仪：接收控制中心指令，同时扫描保护装置机箱条码并传递给控制中心。本系统采用左右两个工装台进行交替式测试，智能测试控制中心根据扫描仪的ID号进行左右测试子系统的识别与控制。

表 2 黄伞子实体多糖对小鼠体质量的影响Table 2 Effect ofPholiota adiposepolysaccharides on body weight of mice

由表2可知，随着实验时间的延长，各组小鼠体质量的增幅分别为空白组32.2%、模型组37.6%、低剂量39.3%、中剂量38.9%、高剂量33.8%，组间增幅无显著性变化(P＞0.05)。每周称量1次，以确定继续灌胃剂量，从表2可以看出各组小鼠生长良好。

2.4 黄伞子实体多糖对小鼠血脂的影响

2.4.1 黄伞子实体多糖对小鼠总胆固醇的影响

由表3可知，黄伞子实体多糖低剂量组和高剂量组有显著降低高血脂小鼠血清总胆固醇的作用(P＜0.05)。灌胃不同剂量的黄伞子实体多糖5周后，与空白组相比，模型组血清总胆固醇含量有极显著性升高(P＜0.01)，表明模型建立成功；灌胃黄伞子实体多糖后，小鼠TC的降幅为7.3%～15.1%，与模型组相比，低剂量组和高剂量组降幅明显(P＜0.05)，中剂量组无显著性变化(P＞0.05)，分析原因可能是，黄伞子实体多糖只有在一定剂量范围内才能发挥降脂作用，高于或低于某一剂量范围，均有显著作用。

2.4.2 黄伞子实体多糖对小鼠甘油三酯的影响

由表3可知，黄伞子实体多糖有显著降低小鼠甘油三酯的作用。饲喂5周后，模型组甘油三酯水平高于空白组54.5%，发生极显著性变化(P＜0.01)，表明模型建立成功；灌胃黄伞子实体多糖5周后，各给药组小鼠TG降幅为26.4%～45.8%，与模型组相比，低剂量组和高剂量组发生极显著性降低(P＜0.01)，中剂量组显著性降低(P＜0.05)，分析原因可能是，黄伞子实体多糖只有在一定剂量范围内才能发挥降脂作用，高于或低于某一剂量范围，均有明显作用。

2.4.3 黄伞子实体多糖对小鼠高密度脂蛋白胆固醇的影响

由表3可知，黄伞子实体多糖有显著提高小鼠高密度脂蛋白胆固醇的作用。饲喂5周后，模型组高密度脂蛋白胆固醇水平低于空白组34.9%，发生显著性变化(P＜0.05)，表明模型建立成功；灌胃黄伞子实体多糖5周后，各给药组小鼠HDL-C增幅为27.4%～55.8%，与模型组相比，低剂量组和高剂量组增幅发生显著性变化(P＜0.05)，中剂量组增幅最为明显为55.8%，发生极显著性变化(P＜0.01)。分析原因可能是，黄伞子实体多糖的最佳作用效果受含量的影响，当高于或低于某一剂量时作用效果不明显，只有在合适的范围才能发挥最佳的降脂效果。

2.4.4 黄伞子实体多糖对小鼠低密度脂蛋白胆固醇的影响

由表3可知，黄伞子实体多糖有显著降低小鼠低密度脂蛋白胆固醇的作用。饲喂5周后，模型组低密度脂蛋白胆固醇水平高于空白组98.2%，升幅极显著(P＜0.01)，表明模型建立成功；灌胃黄伞子实体多糖后，各给药组LDL-C降幅为33.1%～49.5%，与模型组相比，中剂量组和高剂量组降幅显著(P＜0.05)，低剂量组降幅极显著(P＜0.01)。分析原因可能是，当黄伞子实体多糖超过一定剂量时，作用效果变得不明显。

2.4.5 黄伞子实体多糖对小鼠血清抗动脉粥样因子的影响

表 3 黄伞子实体多糖对TC、TG、HDL-C、LDL-C、AI的影响Table 3 Effect ofPholiota adiposepolysaccharides on serum TC, TG, HDL-C, LDL-C and AI levels of mice

由表3可知，黄伞子实体多糖对防止血清动脉粥样硬化具有一定的预防作用。饲喂5周后，模型组血清抗

动脉粥样因子低于空白组65.0%，发生极显著性降低(P＜0.01)，表明模型建立成功；5周后，与模型组相比，各给药组均能不同程度的提高血清抗动脉粥样因子的水平，低剂量组和中剂量组无显著性变化，高剂量组有显著性提高(P＜0.05)，血清抗动脉粥样因子与黄伞子实体多糖成一定的线性关系。

3 结 论

本实验比较了Sevag法和酶+Sevag联合法除蛋白的方法，后者的除蛋白效率明显高于前者，多糖含量为72.88%，Sevag法多糖含量为28.17%，比仅用Sevag法提高了44.71%。可见，在多糖纯化过程中使用蛋白酶除蛋白是非常有效的方法。

血清总胆固醇和甘油三酯的含量是高血脂症的重要指标，而HDL-C/TC的比值更能很好的反映动脉粥样硬化和冠心病的发病率，比单一指标更为灵敏。经过动物实验研究表明，黄伞子实体多糖能显著降低高血脂症小鼠的TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平和AI，对高血脂症的发生有一定的预防作用。但是关于黄伞子实体多糖的进一步分离纯化，结构鉴定，量效关系和降脂机理还需要进一步的研究。

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Purification and Hypolipidemic Effect of Polysaccharides from Fruit Body of Pholiota adipose

LI De-hai1，WANG Zhi-qiang1，SUN Chang-yan2，WANG Ping1,*
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2. Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center, Harbin 150086, China)

Objective∶ To explore the purification method and hypolipidemic effect of polysaccharides from fruit body of Pholiota adipose polysaccharides. Methods∶ The crude polysaccharides were purified after removing protein by neutral protease and Sevag method. Experimental mice were divided into five groups including NS control group, the model group with high fat diet, the treatment groups fed with purified polysaccharides at the low-dosage of 100 mg/(kg bw·d), the medium-dosage of 200 mg/(kg bw·d) and the high-dosage of 400 mg/(kg bw·d). Due to the high fat diet, the model of hyperlipidemia was successfully established. After five weeks, the contents of serum TC, TG, high-density cholesterol (HDL-C), low-density cholesterol (LDL-C) were determined. Results∶ Purified polysaccharides from Pholiota adipose at three dosages exhibited the significant decrease in TC (high-dosage group and low-dosage group P＜0.05), TG (medium-dosage group P＜0.05, high-dosage group and low-dosage group P＜0.01), LDL-C (medium-dosage group and high-dosage group P＜0.05, low-dosage group P＜0.01), the significant improvement in HDL-C (high-dosage group and low-dosage group P＜0.05，medium-dosgage group P＜0.01) and arteriosclerosis factor (AI) (high-dosage group P＜0.05). Conclusion∶ Polysaccharides from Pholiota adipose play an important role in the reduction of blood lipid and prevention of arteriosclerosis in mice.

Pholiota adipose；polysaccharides；hypolipidemia；hypolipidemic effect；mice

TQ929.2

A

1002-6630(2010)09-0268-04

2009-09-18

李德海(1976—)，男，讲师，硕士，主要从事食品化学及植物活性成分研究。E-mail：lidehaineau@163.com

*通信作者：王萍(1964—)，女，教授，博士，主要从事食品化学及植物活性成分研究。 E-mail：wangpingwobs@163.com