米糠抗氧化肽大鼠体外抗氧化作用研究

樊金娟，罗 霞，付岩松，张幼竹，刘广文

(沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110161)

米糠抗氧化肽大鼠体外抗氧化作用研究

樊金娟，罗 霞，付岩松，张幼竹，刘广文

(沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110161)

对米糠抗氧化肽体外抗氧化作用进行研究。结果显示，米糠抗氧化肽(0.32mg/mL)能够抑制血红蛋白氧化反应和红细胞溶血，抑制率为50%左右，表明其对大鼠红细胞和血红蛋白的氧化损伤具有保护作用；米糠抗氧化肽能抑制红细胞及肝组织自氧化产生的MDA和由H2O2诱导产生的MDA，抑制率为41%～60%；并能抑制自由基诱导的大鼠肝组织匀浆中脂褐质的产生。

米糠抗氧化肽；抗氧化；体外

抗氧化剂是生物体实现自我保护的最根本性机制。在生物体内，自由基的增多对生物大分子和膜结构均有不同方式的损伤作用，造成相关细胞结构与功能的破坏，导致疾病的发生[1]。来源于食物蛋白水解物的肽类，不仅具有很高的营养价值，而且无论是从细胞生理学还是代谢功能上越来越显示出优势。它们与机体的各种功能调节、疾病的发生以及免疫、内分泌、衰老、代谢等有着非常密切的关系，在生命活动中起着非常重要的作用，可广泛用作药物、疫苗和食品营养制剂等。

本实验以米糠蛋白酶解物经分子筛层析、离子交换层析等分离纯化过程获得的米糠抗氧化肽为原料，从体外实验研究米糠抗氧化肽的抗氧化活性，为深入研究米糠肽生物活性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

米糠抗氧化肽的制备、分离纯化，按本实验室方法进行[2]。

Wistar大鼠，雄性，体质量200g左右，由长春医学实验动物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 米糠抗氧化肽对血红蛋白氧化反应的影响[3-4]。

Wistar大鼠断头取血，制成抗凝血，以1500r/min，4℃离心5min得红细胞，用冷生理盐水洗3次，用pH7.4的PBS配成20%的红细胞悬液5mL，加入20倍5mmol/L的低渗PBS，4℃溶血30min，18000r/min离心30min，取上清液。1)自氧化体系：取溶血液2mL，加入0.32mg/mL的米糠抗氧化肽100μL，37℃温育24h；两支对照管加入100μL蒸馏水，其中一支37℃温育24h；2)H2O2启动的氧化体系：加样方式同自氧化体系，3 7℃温育10min，加入30mmol/L的H2O2100μL，37℃振荡温育45min，于500～700nm波长处，2nm/s扫描。

1.2.2 米糠肽对大鼠红细胞过氧化溶血的影响[5-7]。

1)红细胞自氧化溶血系统：取1%红细胞悬液10mL，分别加入0.16、0.24、0.32mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 100μL，对照管加100μL蒸馏水，

37℃温育24h。2) H2O2诱发的红细胞氧化溶血系统：加样方法同1)，37℃温育10min，加入终浓度为100mmol/L的H2O2，37℃振荡温育60min。将各系统在1000r/min离心10min，上清液于415nm测定吸光度，计算红细胞氧化溶血抑制率。另取上清1 m L，用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量[8]。

式中：A0为对照管吸光度；A为样品管吸光度。

1.2.3 米糠抗氧化肽对大鼠肝组织匀浆脂质过氧化的影响

1.2.3.1 米糠抗氧化肽对大鼠肝组织匀浆丙二醛(MDA)含量的影响[9-10]。

取5%肝匀浆2mL，分别加入0.16、0.24、0.32mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 100μL，对照管加入100μL蒸馏水，37℃温育10min，加入终浓度为1mmol/L的H2O2，37℃反应30min。取出反应液1mL，TBA法测定MDA含量。

1.2.3.2 米糠抗氧化肽对大鼠肝组织匀浆脂褐质含量的影响

参照文献[11]，稍加改进。取5%的肝组织匀浆5mL，分别加入0.16、0.24mg/mL米糠抗氧化肽及0.24mg/mL GSH 200μL，对照加等量蒸馏水，37℃温育10min，加入终浓度为12mmol/L 的H2O2，37℃反应150min。各管加入体积比2∶1的氯仿甲醇液5mL混匀，3000r/min离心10min，向提取液中加入甲醇0.2mL，轻振混匀，置紫外灯下照射30s，用荧光分光光度计在波长300～400nm范围内扫描最大激发波长，然后以该波长在400～500nm范围内进行发射波长扫描，荧光强度代表脂质过氧化程度。

1.2.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 米糠抗氧化肽对血红蛋白氧化反应的影响

氧合血红蛋白是血红蛋白和氧分子的络合物。血红素铁原子为二价，与O2、卟啉的4个N、珠蛋白的组氨酸残基(咪唑基)结合，成为八面体的络合物，分别在540nm(血红蛋白β链)和575nm(血红蛋白α链)波长处有特异吸收峰。高铁血红蛋白(MetHb)及血红蛋白铁丧失一个电子，在630nm波长有特异吸收峰。正常高铁血红蛋白占血红蛋白总量的1%，较为稳定。

当红细胞发生氧化后，氧合血红蛋白的吸收峰降低，其中α链最为敏感；而高铁血红蛋白的吸收峰增高(图1、2)，更易加速类脂的过氧化，从而导致细胞损伤。

图1 米糠抗氧化肽对大鼠红细胞自氧化体系中血红蛋白含量的影响Fig.1 Effect of rice bran peptides on hemoglobin of red blood cells in autoxidation system

图2 米糠抗氧化肽对大鼠红细胞H2O2诱导氧化体系中血红蛋白含量的影响Fig.2 Effect of rice bran peptides on hemoglobin of red blood cells in H2O2-induced oxidation system

由图1、2可知，米糠抗氧化肽无论对自氧化体系还是H2O2诱导氧化体系中的血红蛋白氧化反应都有一定的抑制作用，抑制率分别为20.86%和22.17%。Stratford等[12-13]曾报道，内脂可加速Hb的氧化速率，异丙酚能抑制脂质诱发的这种加速作用，但并不抑制潜在的氧自由基诱发的氧化反应。由此推断，米糠抗氧化肽对红细胞自由基损伤的保护作用可能与异丙酚相似，主要通过对细胞膜脂质过氧化的抑制作用，从而保护红细胞膜的结构和功能，而对Hb氧化作用的影响可能是次要的。

2.2 米糠抗氧化肽对大鼠红细胞过氧化的影响

红细胞是血液中的主要功能成分，担负着运输O2，排出CO2的重要任务。红细胞膜中含有大量不饱和脂肪酸，在氧分压过高时，可使红细胞膜脂质发生过氧化产生MDA，而MDA是脂质过氧化的主要产物之一，它可以交联磷酯和蛋白质，也可以使蛋白质巯基氧化，从而损伤细胞膜，使之产生溶血[14-15]。在正常生理情况下，由于内源性抗氧化剂的保护作用，红细胞膜的结构与功能基本得到维持，但在疾病、衰老、环境毒物及受到辐射损伤情况下自由基对红细胞膜的损

伤程度可能超过其修复能力，导致膜损伤而发生氧化溶血作用。通过红细胞的氧化溶血反应可以检测自由基损伤程度，也可以通过该反应来评价抗氧化剂的抗氧化效果。

2.2.1 米糠抗氧化肽对大鼠红细胞过氧化溶血的影响

表1 米糠抗氧化肽对大鼠红细胞过氧化溶血的影响Table 1 Effect of rice bran peptides on hemolysis of red blood cells

由表1可知，和对照组相比，在0.16～0.32mg/mL质量浓度范围内，随着米糠抗氧化肽质量浓度的增加，对溶血反应的抑制作用增加，且具有显著作用(P＜0.01)。

双氧水是很强的自由基诱导剂，在大鼠红细胞溶液中添加后促进了红细胞的过氧化溶血反应。与对照组相比，在0.16～0.32mg/mL质量浓度范围内，随着米糠抗氧化肽质量浓度的增加，对溶血反应的抑制作用也增加，且具有显著作用(P＜0.01)。通过与GSH的比较可知，米糠抗氧化肽抑制溶血的能力可与GSH相媲美。

2.2.2 米糠抗氧化肽对大鼠红细胞MDA含量的影响

表2 米糠抗氧化肽对大鼠红细胞MDA含量的影响Table 2 Effect of rice bran peptides on MDA content in red blood cells

由表2可知，与对照组相比，在0.16～0.32mg/mL质量浓度范围内，米糠抗氧化肽各剂量组对大鼠红细胞自氧化和H2O2诱导生成的MDA均有显著的抑制作用(P＜0.01)，说明米糠抗氧化肽在红细胞水平上的抗氧化作用明显。通过与GSH的比较可知，米糠抗氧化肽抑制MDA生成的能力与GSH相当。

2.3 米糠抗氧化肽对大鼠肝组织匀浆脂质过氧化的影响肝组织是动物重要的代谢器官，其匀浆液中含有大量的细胞器和质膜，在体外温育过程中可以发生自氧化反应产生自由基，而这些自由基能通过攻击生物膜中多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化，并形成脂质过氧化物。因此，测定MDA的含量不仅可反映出组织内脂质过氧化程度，还能间接体现出细胞损伤程度。MDA是脂质过氧化的主要产物之一，它可以交联磷脂和蛋白质，也可以使蛋白质的巯基氧化生成脂褐质。通过对脂褐质的测定，可知细胞被自由基损伤的程度，间接反映体内脂质过氧化水平。

2.3.1 米糠抗氧化肽对大鼠肝组织匀浆MDA含量的影响

表3 米糠抗氧化肽对大鼠肝组织匀浆MDA含量的影响Table 3 Effect of rice bran peptides on MDA content in liver tissue

由表3可知，与H2O2诱导对照组相比，在0.16～0.32mg/mL质量浓度范围内，米糠抗氧化肽各剂量组对大鼠肝组织匀浆H2O2诱导组生成的MDA有显著的抑制作用(P＜0.01)，说明米糠抗氧化肽在肝组织水平上的抗氧化作用明显。通过与GSH的比较可知，米糠抗氧化肽的抗氧化作用稍优于GSH。

2.3.2 米糠抗氧化肽对大鼠肝组织匀浆脂褐质含量的影响

脂褐质是丙二醛与游离的氨基类物质(如磷脂酰乙醇胺，蛋白质及核酸)交联而生成的具有荧光的化合物，即Shill碱。用氯仿-甲醇混合为萃取剂，可将其从组织中提取出来。通过对脂褐质的测定，可知道细胞被自由基损伤的程度，间接反映体内脂质过氧化水平。通过荧光分光光度计在300～400nm范围内扫描得最大激发波长为359.6nm；然后在359.6nm最大激发波长下，在400～500nm范围内进行扫描得最大发射波长为431.3nm。在此波长下，测得米糠抗氧化肽对脂褐质产生的影响。

表4 米糠抗氧化肽对大鼠肝组织匀浆脂褐质生成的影响Table 4 Effect of rice bran peptides on the generation of lipofasci in liver tissue

由表4可知，肝组织匀浆在H2O2诱导产生的自由基损伤作用下，形成了脂褐质。与对照组相比，米糠抗氧化肽和GSH对脂褐质的生成都有显著抑制作用(P＜0.01)，且二者抑制能力接近。

3 结 论

3.1 米糠抗氧化肽可减缓自发体系和诱导体系中血红蛋白被氧化的速率，对血红蛋白有一定保护作用。

3.2 米糠抗氧化肽在0.16～0.32mg/mL质量浓度范围内各剂量组能极显著地抑制红细胞的过氧化溶血和丙二醛的生成，并呈一定的量效关系。

3.3 米糠抗氧化肽在0.16～0.32mg/mL质量浓度范围内各剂量组能显著抑制肝匀浆的过氧化反应。

自由基的增多会引起蛋白质、DNA等生物大分子的氧化损伤，甚至破坏细胞的正常结构和功能，导致疾病的发生。动物体外实验表明，米糠抗氧化肽能够抑制血红蛋白氧化速率及红细胞过氧化溶血，同时能降低肝组织MDA和脂褐质的产生，其抗氧化活性可与GSH相媲美，为进一步研究米糠抗氧化肽的体内抗氧化活性及相关免疫调节活性提供了参考。

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Antioxidant Effect of Rice Bran Peptides in Rats

FAN Jin-juan，LUO Xia，FU Yan-song，ZHANG You-zhu，LIU Guang-wen
(College of Biotechnology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China)

In this study, biological functions of rice bran antioxidant peptides were investigated. Results indicated that rice bran antioxidant peptides exhibited an effective scavenging capability to free radicals and inhibit peroxide reactions of hemoglobin and hemolysis of red blood cells (RBC); moreover, rice bran antioxidant peptides also revealed an excellent inhibition effect on MDA generated from RBC, liver tissue and H2O2 oxidation system. Furthermore, rice bran antioxidant peptides also could suppress the generation of lipofasci from liver tissues induced by H2O2.

rice bran antioxidant peptide；antioxidation；in vitro

TQ936.16

A

1002-6630(2010)09-0251-04

2009-07-03

辽宁省教育厅重点实验室项目(2008S207)

樊金娟(1972—)，女，副教授，博士，研究方向为植物资源开发与利用。E-mail：jinjuanf@hotmail.com