米根霉不同菌丝体形态对重复间歇发酵生产L-乳酸的影响

郑 志，杜 威，姜绍通*，吴学凤，李兴江，罗水忠，张任远

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

米根霉不同菌丝体形态对重复间歇发酵生产L-乳酸的影响

郑 志，杜 威，姜绍通*，吴学凤，李兴江，罗水忠，张任远

(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009)

研究米根霉在3L发酵罐重复间歇发酵过程中，菌体形态对发酵强度的影响。结果表明：絮状米根霉首批发酵产L-乳酸为105.8g/L，葡萄糖转化率88.12%，球状米根霉产L-乳酸105.0g/L，葡萄糖转化率87.50%；在重复间歇发酵过程中，球状米根霉前6批产L-乳酸均保持在80.00g/L以上，第7批产L-乳酸78.60g/L，葡萄糖转化率均高于87.33%，产酸效率最高可达到4.26g/(L·h)，而絮状米根霉前4批产L-乳酸可保持在80.00g/L以上，第5批产L-乳酸78.30g/L，第6批产L-乳酸77.40g/L，第7批产L-乳酸70.20g/L，产酸效率最高可达4.07g/(L·h)。研究数据显示，球状米根霉更适于重复间歇发酵生产L-乳酸。

L-乳酸；米根霉；形态；重复间歇发酵

L-乳酸是一种重要的天然有机酸，在食品、医药、生物降解塑料的制造上有广泛应用[1]。L-乳酸经聚合作用生成生物可降解塑料聚L-乳酸，可以解决大量废弃塑料所造成的环境污染问题，对于农副产品深加工及环境保护都具有重要的意义[2-4]。米根霉以其营养要求粗放，菌丝体大而易于分离，L-乳酸纯度高，易于精制，有利于工业化生产高纯度的L-乳酸，成为国内外广泛采用发酵生产的菌种[5]。

米根霉深层发酵生产L-乳酸过程中，菌体表现出多样的形态，主要有絮状体、菌球、块状聚结物[6]。不同的菌体形态，其发酵效率有很大区别。Yu等[7]在发酵过程中通过补充硫酸氨控制米根霉保持絮状形态，达到109.0g/L，产酸效率2.73g/(L·h)。Kosakai等[8]在米根霉培养液中加入无机载体和聚乙烯氧化物形成菌丝絮凝体，L-乳酸的产量为103.6g/L，产酸效率1.70g/(L·h)。Park等[9]利用此种絮状体在气升式反应器中发酵生产

L-乳酸，L-乳酸的产量为104.6g/L，产酸效率1.80g/(L·h)。Liu等[10]通过优化发酵条件得到球状菌体，L-乳酸的产量为92.00g/L，产L-乳酸效率0.70g/(L·h)。Bai等[11]通过控制米根霉的发酵条件使其为菌球形，在大大降低发酵液黏度的同时，产L-乳酸达到76.10g/L，产酸效率2.11 g/(L·h)。Zhou等[12]研究一种小球体形态的米根霉在泡罩塔反应器中的发酵特性，产酸效率为2. 58g/(L·h)。块状的菌体形态在发酵过程中接种量难于控制，且极大限制了菌体内部的传氧、传质，产物产量明显偏低，一般不选用[13]。正是由于米根霉发酵过程中菌体形态不同，影响了发酵过程中传质、溶氧等性能，致使发酵效率有很大不同。

本实验在确定絮状米根霉及球状米根霉最优发酵条件基础上，对比研究絮状米根霉和球状米根霉在重复间歇发酵生产L-乳酸过程中的发酵状态，稳定性及产酸效率，以期为米根霉重复间歇发酵生产L-乳酸的工业化实施提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

米根霉AS3.819，保藏在PDA培养基上，每两个月转接一次斜面。孢子由PDA培养基产生，用无菌蒸馏水洗下孢子制成悬液。

1.1.2 培养基

菌种保藏斜面培养基：马铃薯葡萄糖培养基(P D A)。

絮状米根霉发酵培养基(g/L)：葡萄糖1 2 0、(NH4)2SO43.00、KH2PO40.10、MgSO4·7H2O 0.25、ZnSO4·7H2O 0.05、NaH2PO40.25、CaCO360.00。

球状米根霉发酵培养基(g/L)：葡萄糖1 2 0、(NH4)2SO43、KH2PO40.15、MgSO4·7H2O 0.2 5、ZnSO4·7H2O 0.25、NaH2PO40.15、CaCO360。

间歇补料培养基(g/L)：葡萄糖 90、(NH4)2SO43、KH2PO40.075、MgSO4·7H2O 0.35、 ZnSO4·7H2O 0.22、CaCO345。

1.2 方法

1.2.1 斜面培养

将斜面置于32℃霉菌培养箱，培养时间3d。

1.2.2 发酵罐培养

3L发酵罐装入2L的培养液，121℃灭菌15min，接种，发酵温度32℃，发酵罐压力0.05MPa，絮状米根霉搅拌速率200r/min，球状米根霉搅拌速率400r/min，培养40～55h。

1.2.33 L发酵罐半连续发酵

首批发酵结束后停止搅拌，5min后，球状米根霉沉降于发酵罐底部，15min后，絮状米根霉沉降于发酵罐底部。通气使发酵罐保压在0.1MPa左右，通过压力将发酵液从取料装置压出总发酵液体积的4/5，加入灭菌后的间歇补料培养基，继续发酵，发酵期间参数控制同1.2.2节。

产酸效率按式(1)计算。

所有实验平行重复3次，实验结果取平均值。

1.2.4 检测方法

L-乳酸含量测定：高效液相色谱校正的EDTA定钙法[14]；还原糖测定：3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)[15]；生物量测定：菌体干质量法[16]。

2 结果与分析

2.1 米根霉发酵生产L-乳酸的菌体形态研究

米根霉在上述成絮状和球状菌丝体的发酵条件下培养48h，分别取其菌丝体，并进行显微观察，结果见图1、2。

图1 球状米根霉(a)和絮状米根霉(b)形态Fig.1 Morphology ofRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form

图 2 球状米根霉(a)(×100)和絮状米根霉(b)(×400)在显微镜下形态Fig.2 Micrograph ofRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form

由图1可看出，球状菌丝体大小较均一，小球直径1mm左右；絮状菌丝体则为乳白色棉絮状。图2显微观察可知，絮状菌体菌丝粗壮，无自溶现象，处于生长旺盛期；球状菌体菌球中心菌丝致密，而边缘较为松散，属松散型菌球。文献[13]报道此两种米根霉菌体形态均可正常高效发酵生产L-乳酸。

2.2 米根霉发酵生产L-乳酸的动力学研究

2.2.1 首批发酵动力学

测定发酵液中的米根霉生物量、葡萄糖质量浓度和L-乳酸质量浓度，即研究菌体生长、糖代谢和产酸的动力学，结果见图3。

图 3 首批球状米根霉(a)和絮状米根霉(b)发酵动力学曲线Fig.3 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the first batch fermentation

由图3a可以看出，发酵初期的12h，L-乳酸和生物量很少，即菌体生长与生产缓慢，处于生长阶段的延滞期；18h至52h，菌体迅速增长的同时L-乳酸质量浓度也随之迅速增加，这段时间是米根霉生长与生产旺盛时期，处于对数生长期；52h后乳酸质量浓度基本保持稳定，生物量变化不大，发酵进入稳定期。图3b显示结果基本与图3a相同，发酵初期的18h菌体生长与生产缓慢，24h至48h是米根霉生长与生产旺盛期，48h后进入稳定期。

综合图3可以得出，絮状米根霉与球状米根霉进入稳定期后产L-乳酸和生物量相当，球状米根霉和絮状米根霉产酸分别为105.0g/L和105.8g/L，生物量分别为8.055g/L和8.202g/L。球状米根霉首批发酵36～42h，L-乳酸对基质得率最大为2.914g/g，而絮状米根霉首批发酵48～52h，L-乳酸对基质得率最大为2.893g/g，由此可知，首批发酵中，球状米根霉和絮状米根霉发酵效率基本相同。

2.2.2 重复批次发酵动力学

首批发酵结束后，分别使球状和絮状米根霉菌丝体自然沉降于发酵罐底部。通过压力将发酵液排出4/5后，再加入补料培养基进行重复批次的发酵。分别测定了第3批和第6批发酵液中的葡萄糖质量浓度和L-乳酸质量浓度，即研究糖代谢和产酸的动力学，结果见图4、5。

图4 第3批球状米根霉(a)和絮状米根霉(b)发酵动力学曲线Fig.4 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the 3rdbatch fermentation

图5 第6批球状米根霉(a)和絮状米根霉(b)发酵动力学曲线Fig.5 Kinetic curves of fermentations byRhizopus oryzaestrains in pellet-form and flocs-form during the 6thbatch fermentation

由图4可以看出，第3批时，球状米根霉发酵19h即达到发酵终点，葡萄糖质量浓度为1.90g/L；絮状米霉发酵20h达到发酵终点，葡萄糖质量浓度为2.10g/L。

由图5可以看出，第6批时，球状米根霉和絮状米根霉均发酵24h达到发酵终点，葡萄糖质量浓度分别为2.10g/L和 3.20g/L。数据显示，球状米根霉和絮状米根霉在第6批发酵时，发酵时间均较第3批长，剩余葡萄糖质量浓度均较第3批含量高，说明球状米根霉和絮状米根霉的产酸效率随批次的增加而下降。

球状米根霉和絮状米根霉在重复间歇发酵生产L-乳酸过程中糖耗和产酸都基本趋于线性，无延滞期。这是因为米根霉细胞在首批发酵主体已增殖完毕，形成了菌丝体在后续重复批次的发酵中，继续发酵转化葡萄糖为L-乳酸。这样，既减少了碳源用于生物量扩增的消耗，提高了原料葡萄糖转化率，又极大缩短了发酵周期，从而实现提高发酵强度的目的。本研究结果也表明，絮状米根霉和球状米根霉都符合重复间歇发酵的特点，二者均可重复间歇发酵生产L-乳酸。

2.3 米根霉菌体形态对重复间歇发酵生产L-乳酸稳定性的影响

在上述重复批次发酵中，每批次均取样检测L-乳酸产量并计算产酸效率，结果见图6、7。

图 6 米根霉形态对重复间歇发酵稳定性的影响Fig.6 Effect ofRhizopus oryzaemorphology on stability of repeated intermittent fermentation

图 7 米根霉形态对重复间歇发酵产酸效率的影响Fig.7 Effect ofRhizopus oryzaemorphology on fermentation efficiency of repeated intermittent fermentation

由图6可知，球状米根霉在前6批产L-乳酸质量浓度均保持在80.00g/L以上，葡萄糖转化率高于88.80%，在第7批时略有下降但均高于87.33%；而絮状米根霉前4批可保持在80.00g/L以上，第5批开始下降，且至第7批时下降趋势尤为明显。

由图7可知，重复间歇发酵批次中，球状米根霉产酸效率最高为4.26g/(L·h)，絮状米根霉产酸效率最高为4.07g/(L·h)。且在各批次产酸效率比较中，球状米根霉均高于絮状米根霉。

综合图6、7可知，球状米根霉的稳定性优于絮状米根霉。结合图4、5中重复间歇发酵批次的动力学发现，絮状米根霉和球状米根霉均可重复间歇发酵生产L-乳酸，但球状米根霉在重复间歇发酵批次中，产酸效率高，稳定性好，相对絮状米根霉而言，更适合重复间歇发酵。

3 结 论

3.1 首批罐发酵絮状米根霉产L-乳酸105.8g/L，葡萄糖转化率88.12%，球状米根霉产L-乳酸105.0g/L，葡萄糖转化率87.50%。

3.2 重复间歇发酵批次中，球状米根霉前6批产L-乳酸均保持在80.00g/L以上，葡萄糖转化率高于88.89%，产L-乳酸速率最高可达到4.26g/(L·h)，在第7批时产L-乳酸略有下降，为78.60g/L，葡萄糖转化率为87.33%；絮状米根霉前4批产L-乳酸可保持在80.00g/L以上，产L-乳酸速率最高可达4.07g/(L·h)，在第5批时产酸开始下降，至第7批时产L-乳酸仅为70.20g/L，葡萄糖转化率为78.00%。

3.3 米根霉重复间歇发酵生产L-乳酸过程中，菌体形态对其生长状态，产酸效率和稳定性有很大的影响，相对于絮状米根霉，球状米根霉具有稳定性好，产酸效率高的优点，故球状米根霉更适于重复间歇发酵生产L-乳酸。

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Effect of Mycelia Morphology of Rhizopus oryzae on Repeated Intermittent Fermentation of L-lactic Acid

ZHENG Zhi，DU Wei，JIANG Shao-tong*，WU Xue-feng，LI Xing-jiang，LUO Shui-zhong， ZHANG Ren-yuan
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect of Rhizopus oryzae strain on fermentation intensity of L-lactic acid during repeated intermittent fermentation in a 3 L fermentor were investigated. Results demonstrated that the yields of L-lactic acid were 105.8 g/L and 105.0 g/L through in the first batch fermentation by Rhizopus oryzae strain in flocs-form and pellet-form, and glucose conversion rates were 88.12 % and 87.50%, respectively. The average yield of L-lactic acid fermentation through Rhizopus oryzae strain in pellet-form was more than 80.00 g/L during the first 6 repeated intermittent fermentations. The glucose conversion rate was higher than 87.33%, and the highest L-lactic acid productivity was 4.26 g/(L·h). However, the yield of L-lactic acid was decreased to 78.60 g/L in the 7th batch fermentation. The average yield of L-lactic acid fermentation through Rhizopus oryzae strain in flocs-form was more than 80.00 g/L during the first 4 repeated intermittent fermentations. But the yield of L-lactic acid was decreased to 78.30, 77.40 g/L and 70.20 g/L in the following 3 batches of fermentation. The highest productivity for L-lactic acid reached up to 4.07 g/(L·h).

L-lactic acid；Rhizopus oryzae；morphology；repeated intermittent fermentation

TQ921. 3

A

1002-6630(2010)09-0166-05

2009-09-02

国家“863”计划重点项目(2007AA10Z361)

郑志(1971—)，男，副教授，博士，研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail：zhengzhi@hfut.edu.cn

*通信作者：姜绍通(1954—)，男，教授，博士，研究方向为农产品资源综合利用。E-mail：jianshaotong@yahoo.com.cn