响应面分析果胶酶提高人参果出汁率的工艺参数

苏凤贤，王晓琴，苟亚峰，樊子豪，杜双虎，张芬琴,*

(1.河西学院生命科学与工程系，甘肃 张掖 734000；2.河西学院生态研究所，甘肃 张掖 734000)

响应面分析果胶酶提高人参果出汁率的工艺参数

苏凤贤1,2，王晓琴1,2，苟亚峰1，樊子豪1，杜双虎1，张芬琴1,2,*

(1.河西学院生命科学与工程系，甘肃 张掖 734000；2.河西学院生态研究所，甘肃 张掖 734000)

果胶酶可以促进果胶水解，提高水果的出汁率。运用响应面法和灰色关联分析优化果胶酶影响人参果出汁率的工艺参数，建立相应的回归模型Y= 89.78333＋0.86250x3＋0.67917x4＋0.80937x32－0.83125x1x2。方差分析结果表明，酶解时间、果胶酶用量对人参果出汁率影响显著(P＜0.05)，而酶解温度、初始pH值对出汁率无显著影响(P＞0.05)。多元回归分析结果显示，初始pH值、酶解温度、酶解时间及果胶酶用量与出汁率之间回归模型拟合程度较好，可用于实际生产预测。

果胶酶；出汁率；二次正交旋转组合设计；响应面法(RSM)；灰色关联分析

人参果又名香艳茄、香瓜茄、茄瓜，原产南美洲，属茄科(Solanaceae)类多年生双子叶草本植物[1]。人参果是一种高营养水果，果肉清香多汁，腹内无核，风味独特，具有高蛋白、低脂肪、低糖等特点，同时富含多种维生素、氨基酸以及微量元素，尤其富含被称为“生命火种、抗癌之王”的硒元素。人参果具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖、稳定血压、糖尿病、提高免疫功能等功效，是理想的食疗保健水果[2-3]。

果胶是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，存在于大多数新鲜水果细胞壁和胞间层，不溶于水，为内部细胞的支撑物质。当水果破碎后，果胶和原果胶进入果汁中，使果汁变得黏稠，影响过滤澄清。果胶酶是指分解果胶质的一类酶的总称，包括果胶分解酶、果胶脂酶和多聚半乳糖醛酸酶等，其作用是分解植物细胞壁上的多聚糖类基质，使果蔬汁自流量增加[4]，也可以将果胶分解成果胶酸小分子物质[5]，或者控制果汁中的浸渍作用、脱去果胶[6]，使榨汁变得更容易，进而提高出汁率，有助于过滤。资料表明，人参果成熟果实含有的果胶物质高达26.7～34.5mg/100g鲜质量[7]，这些果胶物质的存在严重影响果酒榨汁工艺。本工作利用DPS软件进行二次正交旋转组合设计，通过响应面法和灰色关联分析优化果胶酶在人参果酒压榨工艺中的应用条件，目的在于促进果胶物质水解，提高人参果的出汁率，节约成本，为后续进行的人参果酒发酵研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人参果：市售，产于甘肃武威张义镇，果实长圆形，直径3～4cm，外表呈黄色并有清晰的棕色纹络；蔗糖 市售优质白砂糖；果胶酶(10000U/g) 武汉远城科技发展有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JJ-2型高速组织捣碎匀浆机 江苏金坛市亿通电子有限公司；TD5A-WS型低速离心机 江苏金坛市恒丰仪器制造有限公司；HH-4型数显电子恒温水浴锅 江苏金坛市宏华仪器厂；PHS-3C型酸度计 江苏金坛市科兴仪器厂；AL204分析天平 瑞士梅特勒-托利多集团。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

人参果→分选→清洗→打浆→酶解→灭酶→过滤→人参果汁

1.3.2 单因素试验

研究表明，影响果胶酶酶解作用的因素有：p H值、酶解温度、酶解时间、加酶量以及底物浓度等。试验选取其中前4个因素作为考察对象，同时，为最大限度地保留人参果的原有成分，除考察初始pH值对人参果出汁率的影响时调整了人参果浆的pH值外，考察其他几个单因素对人参果出汁率的影响时都选择在自然pH值及底物浓度下进行。

1.3.2.1 初始pH值对人参果出汁率的影响

将人参果浆添加0.3g/kg果胶酶后用柠檬酸分别调整初始pH值至3.0、3.5、4.0、4.5和5.0，置于40℃恒温水浴锅中酶解75min，取出样品，灭酶(加热至沸2min，下同)后离心过滤，测定所得人参果汁质量，计算出汁率。

1.3.2.2 酶解温度对人参果出汁率的影响

将人参果浆添加0.3g/kg果胶酶在自然pH值下分别置于30、35、40、45、50、55℃恒温水浴锅中酶解75min，取出样品，灭酶后离心过滤，测定所得人参果汁质量，计算出汁率。

1.3.2.3 酶解时间对人参果出汁率的影响

将人参果浆添加0.3g/kg果胶酶在自然pH值下于40℃恒温水浴锅中分别酶解45、60、75、90、105、120min，取出样品，灭酶后离心过滤，测定所得人参果汁质量，计算出汁率。

1.3.2.4 果胶酶用量对人参果出汁率的影响

将人参果浆分别添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/kg果胶酶在自然p H值下置于4 0℃恒温水浴锅中酶解75min，取出样品，灭酶后离心过滤，测定所得人参果汁质量，计算出汁率。

1.3.3 不同因素处理的人参果出汁率优化设计

1.3.3.1 回归模型设计

统计设计是一个可以用于解释加工过程中各影响参数之间交互作用以及找出主要因素的强大的工具[8]。响应面法(response surface methology，RSM)是利用合理的试验设计方案，采取特定统计技巧来用于回归建模、评估试验中各影响因素的作用以及寻找令人满意的响应值的最优化条件的一种统计方法[9]。其中二次回归旋转组合设计是一种同时具有正交性和旋转性的试验设计方法[10-11]，该方法将试验数据进行中心标准化处理以消除量纲上的差异，编码值的取值均限制在[－2，2]，在编码空间中处于完全平等的地位，所以可直接从回归系数绝对值的大小看出其对响应值影响的大小[12]。因该方法的回归计算及统计检验计算复杂，且变量较多，因此通常采用计算机辅助设计的方法来实现[13-14]。

本实验在单因素试验的基础上，使用DPS软件对果胶酶初始pH值、酶解温度、酶解时间和果胶酶用量4因素进行二次回归旋转组合设计，研究其对人参果出汁率的影响。因素水平编码及试验方案见表1，试验结束后再使用该软件对试验数据进行响应面分析和灰色关联分析。

表1 试验因素水平与编码表Table 1 Factors and levels in the quadratic rotary combination design

1.3.3.2 灰色关联分析

对于一个灰色系统进行分析研究时，首先要解决如何从随机的时间序列中找到关联性，计算关联度，以便为因素判别、优势分析和预测精度检验等提供依据。根据上述原则，初步选取相关指标进行分析，同时为消除不同指标的量纲(或单位)，使各指标间具有可比性，对原始数据处理可采用初值化、均值化、标准值化、中值化、区间化等方法[15]，本实验采用标准化方法进行变换。而在时刻t=k时母序列｛X0(k)｝与子序列｛Xi(k)｝的关联系数L0i(k)可由式(2)计算：

式中：Δ0i(k)表示k时刻两比较序列的绝对差，即Δ0i(k)= X0(k)－Xi(k) (1≤i≤m)；Δjmax和Δjmin分别表示所有比较序列各个时刻绝对差中的最大值与最小值，因为比较序列相交，故一般取Δjmin=0；ρ称为分辨系数，其意义是削弱最大绝对差数值太大引起的失真，提高关联系数之间的差异显著性，ρ∈(0,1)，一般情况下可取0.1～0.5。

关联系数反映两个被比较序列在某一时刻的紧密(靠近)程度。关联度分析实质上是对时间序列数据进行几何关系比较[16]，用式(3)进行计算：

式中：roi为子序列i与母序列0的关联度；N为比较序列的长度(即数据个数)。

1.3.3.3 响应面设计优化验证果胶酶对人参果出汁率的影响因素

在灰色关联分析及二次回归旋转组合设计试验结果基础上，以果胶酶初始pH值、酶解温度、酶解时间和果胶酶用量4个因素作为响应因素，以出汁率作为响应值(Y)，运用DPS软件进行响应面分析，进一步优化验证果胶酶对人参果出汁率的影响因素。

2 结果与分析

2.1 初始pH值对人参果出汁率的影响

图1 初始pH值对人参果出汁率的影响Fig.1 Effect of initial pH on juice yield

由图1可知，果胶酶初始pH值不同对人参果出汁率影响不同。随着初始pH值升高，人参果出汁率呈开口向下的抛物线形状。当pH3.5时，人参果出汁率达到最高88%，之后随pH值升高出汁率迅速下降。这可能是因为果胶酶的活性受pH值影响，处于最适pH值时酶的活性最高，而高于或低于此值时都会导致酶活下降，故选择pH3.5较为适宜。此结论比商业用途果胶酶最活跃的pH值范围4.5～5.5要低[4]。

2.2 酶解温度对人参果出汁率的影响

图2 酶解温度对人参果出汁率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on juice yield

由图2可知，人参果出汁率随果胶酶酶解温度升高而显著增加，并于50℃时达到最大82.3%，55℃时出汁率反而下降2.5%。果胶酶作为一种酶类是活细胞所产生的具有生物催化作用的一类特殊的有机物质，具有一定的最适温度，在此范围内，当温度较低时，随着温度的升高，果胶酶的活性也逐渐提高，待达到最适温度时，果胶酶的催化能力最高；但高于最适温度后，酶的催化能力又迅速下降，并最终完全失去催化能力。因此以50℃作为果胶酶的最适酶解温度较为适宜。

本实验找到的酶解温度最适参数比Thongsombat等[17]报道的果胶酶最佳酶解温度45℃略高，这可能是因为两个实验所采用酶的种类和纯度不同造成；但本试验结果与杜双奎等[18]和周家华等[19]所报道果胶酶最适酶解温度50℃一致，介于商业化果胶酶最适宜的活性温度45～55℃[4]之间。

2.3 酶解时间对人参果出汁率的影响

图3 酶解时间对人参果出汁率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on juice yield

酶解时间是影响人参果出汁率的重要因素之一，研究表明，二者在一定范围内呈正相关。但是酶解时间又不能无限制延长，这是因为随着处理时间的延长，一方面增加了生产企业的成本，另一方面也有可能在提取过程中造成人参果营养成分的流失。从图3可知，虽然在酶解105min时人参果出汁率达到最高94.3%，可是该值与酶解90min时93.3%的出汁率相比并无显著提高，因此，考虑生产成本因素，酶解时间最终选择90min。

2.4 果胶酶用量对人参果出汁率的影响

图4 果胶酶用量对人参果出汁率的影响Fig.4 Effect of enzyme load on juice yield

图4 可见，人参果出汁率与果胶酶用量之间呈正相关，当果胶酶用量为0.4g/kg时，人参果出汁率达到最高94%；而果胶酶用量增加到0.5g/kg时，人参果出汁率反而下降了0.7%，故本实验果胶酶的最适用量确定为0.4g/kg，这一结果比张素霞[20]研究结果果胶酶最适用量0.36g/kg略高，而与不添加果胶酶相比，人参果出汁率整整提高了16.5%，由此可见，添加果胶酶可以显著提高果蔬的出汁率。

2.5 不同因素处理的人参果出汁率工艺参数优化

表2 四因素二次回归旋转组合设计及结果Table2 Quadratic rotary combination design layout and experimental results

根据以上单因素试验结果，使用DPS软件对4个因素按表1的编码水平进行二次回归旋转组合设计，结果见表2。

2.5.1 灰色关联分析

各处理因素与人参果出汁率的关联系数及加权灰色关联度计算结果见表3。

表3 人参果出汁率与各因素的关联序Table3 Correlation coefficients of juice yield with four technological parameters

从表3分析结果来看，人参果出汁率与果胶酶初始p H值、酶解温度、酶解时间、果胶酶用量之间的关联序为x3＞ x1＞ x4＞ x2，即人参果出汁率与各处理之间的关联度第一位是果胶酶酶解时间，其次是人参果初始pH值，再次是果胶酶用量和酶解温度。

2.5.2 回归模型的建立

运用DPS软件处理二次回归旋转组合设计试验结果，建立不同因素处理的人参果出汁率模拟回归模型。

出汁率初步回归方程：

由于各因素对人参果出汁率的影响不是简单的线性关系，为了更明确各因素的影响大小，需对其进一步进行多元回归分析[21]，结果见表4，并在α=0.05显著水平剔除回归方程中不显著项后，得到简化后的回归模型：

从表4的回归模型方差分析可以看出，影响人参果出汁率的主要因素为x3和x4，即酶解时间和果胶酶用量，特别是一次项中x3因素和二次项中x32具有极高的显著性(P＜0.01)。对回归系数进行检验，表明初始pH值和果胶酶酶解温度的交互作用与人参果出汁率呈负效应，而酶解时间和果胶酶用量的一次项以及酶解时间的二次项对人参果出汁率影响为正效应。其他变量的影响均不显著(P＞0.05)，无统计学差异。

对表4失拟项作F检验，F1=1.716＜F0.05(dfLF，dfe)，说明失拟项在0.05水平上不显著，进一步用统计量F2对回归方程作F检验，F2=2.428＞F0.05(dfr，dfs)，说明回归方程在0.05水平上显著，试验数据与所采用的二次数学模型基本上是符合的。二次回归方程与实际情况拟合程度较好，可以用于不同处理对人参果出汁率影响的预测，具有实际应用意义。

表4 回归模型方差分析Table4 Analysis of variance for the established regression model

2.5.3 果胶酶对人参果出汁率影响因素优化

固定其他3个因素于零水平，求第4个因素与因变量的回归方程，根据这些方程得到4个因素对人参果出汁率影响的关系曲线，见图5。

图5 单因素与出汁率关系图Fig.5 Plots of juice yield versus different levels of each technological parameter (three others fixed at zero level)

由图5可以看出，随着果胶酶用量增加，人参果出汁率逐渐升高，二者呈线性正相关；而人参果出汁率与果胶酶酶解时间却呈开口向上的抛物线形状，并于＋2水平处取得极大值；酶解温度与初始pH值的变化对人参果出汁率无统计学影响；人参果出汁率最高出现在＋2水平处。

固定两个因素于零水平，研究其他两个因素间的交互效应，用DPS软件制作出响应面图(图6)。

图6 影响人参果出汁率各因素间响应面图Fig.6 Response surface diagrams displaying the pairwise interactive effects of four technological parameters on juice yield

从图6可以看出，当把果胶酶酶解温度、果胶酶用量固定于零水平或把初始pH值、果胶酶用量固定于零水平时，初始pH值或酶解温度变化均未引起人参果出汁率的变化，即二者对出汁率无统计学影响；而随着酶解时间的延长，人参果出汁率却呈开口向上的抛物线形状，只有在酶解时间较长的时候出汁率才取得极大值(图6a、b)；当把初始pH值、酶解温度固定于零水平时，随着酶解时间延长，出汁率呈开口向上的抛物线，并于酶解时间处于＋2水平时取得极大值；果胶酶用量与出汁率呈正相关，随着果胶酶用量的增加，出汁率呈缓慢上升趋势，并于酶解时间与果胶酶用量均取处于＋2水平时，出汁率取得极大值(图6c)。

响应面的绘制进一步验证了2.5.2节二次旋转正交组合设计建模及方差分析中所得结论。

3 结 论

3.1 通过回归建模和统计分析发现影响人参果出汁率的各因素间存在多重共线性。因此本研究使用一般的回归分析并不合适。

3.2 灰色关联分析可对多重共线性样本数据有较好的处理。本实验采用灰色关联分析技术，确认果胶酶初始p H值、酶解温度、酶解时间、果胶酶用量对人参果出汁率起重要作用；分析结果显示关联序与回归模型基本相符(只有二三位关联序有微弱差别)，说明灰色关联分析可以用于多重共线性数据资料的分析处理。

3.3 通过4因素5水平的二次回归旋转组合设计，用DPS软件进行回归分析和响应面分析，建立了人参果出汁率与果胶酶初始pH值、酶解温度、酶解时间、果胶酶用量关系的回归模型Y= 89.78333＋0.86250x3＋0.67917x4＋0.80937x32－0.83125x1x2。从统计分析结果可知，不同酶解时间和果胶酶用量对人参果出汁率影响显著(P＜0.05)，而初始pH值和酶解温度对出汁率则无统计学影响(P＞0.05)。方差分析结果显示该回归模型的建立拟合性较好，说明可以将其用于生产预测，具有实际应用意义。

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Optimization of Technological Parameters for Pectinase Hydrolysis for Improved Pepino Juice Yield Using Response Surface Analysis

SU Feng-xian1,2，WANG Xiao-qin1,2，GOU Ya-feng1，FAN Zi-hao1，DU Shuang-hu1，ZHANG Fen-qin1,2,*
(1. Department of Life Science and Engineering, Hexi University, Zhangye 734000, China；2. Institute of Ecology, Hexi University, Zhangye 734000, China)

The optimization of four technological parameters for the pectinase hydrolysis was carried out using response surface and grey correlation analyses in order to improve juice yield. A regression model with juice yield (Y) as a function of initial pH (x1), hydrolysis temperature (x2), hydrolysis time (x3) and enzyme load (x4) was set up as follows: Y = 89.78333＋0.86250x3＋0.67917x4＋0.80937x32－0.83125x1x2. The analysis of variance for the model showed that hydrolysis time and enzyme load significantly affected juice yield (P＜0.05) and that the others had no significant effect on juice yield (P＞0.05). The multiple regression analysis indicated that the established model had an excellent goodness of fit, suggesting good reliability in predicting the function.

pectinase；juice yield；quadratic rotary combination design；response surface methodology (RSM)；grey correlation analysis

Q814

A

1002-6630(2010)20-0083-06

2010-01-01

苏凤贤(1974—)，女，讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：supeiecho@sina.com

*通信作者：张芬琴(1963—)，女，教授，博士，研究方向为生化与生物技术。E-mail：fenqinzh@hxu.edu.cn