不同来源胶原肽的抗氧化活性及吸湿保湿性能

贾建萍，鲁健章，周彦钢，程 敏，叶小弟，郑高利*

不同来源胶原肽的抗氧化活性及吸湿保湿性能

贾建萍，鲁健章，周彦钢，程 敏，叶小弟，郑高利*

(浙江省医学科学院，浙江 杭州 310013)

目的：对不同来源(猪皮、牛皮、驴皮、鳕鱼皮、牛骨)胶原肽的抗氧化活性和吸湿保湿性能进行比较研究。方法：采用清除 DPPH自由基和 ABTS+·及还原力测定进行胶原肽抗氧化活性的评价，同时对胶原肽的吸湿性和保湿性进行比较分析。结果：驴皮胶原肽具有较强的清除DPPH自由基的能力，IC50值为0.63mg/mL。鳕鱼皮胶原肽具有较强的清除ABTS+·的能力，IC50值为0.12mg/mL。驴皮胶原肽具有较强的还原力，在质量浓度10mg/mL时，OD700nm值为0.61。驴皮胶原肽具有较好的吸湿保湿性，在相对湿度43%的环境下，24h，吸湿率10.17%、72h，保湿率98.90%。结论：驴皮胶原肽具有很好的抗氧化性和吸湿保湿性。

胶原肽；抗氧化活性；吸湿性；保湿性

胶原肽是由动物胶原蛋白经酶解得到的一类分子质量较小的酶解产物，主要由蛋白质、肽和氨基酸组成。胶原肽具有许多生理功能：抗氧化、降血压、促进矿物元素吸收、提高免疫力、抗菌等，具有抗氧化作用的胶原肽主要来源于动物表皮、骨等结缔组织，已广泛应用于药品、食品及化妆品工业中[1-5]。目前市场上宣传抗氧化作用的胶原肽产品名目繁多，但是尚未见有关对不同来源胶原肽进行抗氧化活性比较研究的报道。

DPPH 自由基是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，在517nm波长处有最大吸收，与抗氧化剂反应时，其中的孤对电子与抗氧化剂中的电子配对使其乙醇溶液由紫色褪色成黄色，褪色程度反映抗氧化活性，已广泛用于抗氧化活性的评价。ABTS+·水溶液呈蓝绿色，在734nm波长处有最大吸收，与抗氧化剂反应会使反应体系褪色，同样，褪色程度反应抗氧化活性大小。还原力测定原理是样品将赤血盐(K3Fe(CN)6)还原成黄血盐(K4Fe(CN)6)，黄血盐再与Fe3+作用，生成普鲁士蓝(在700nm波长处有最大吸收)，样品的还原力以OD700nm表示，光密度越高，还原力越强。

本研究测定不同来源胶原肽清除2,2-二苯基-1-苦基

肼(DPPH)自由基和2,2-联氮-双-(3-乙基苯并塞唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS+·)的能力以及还原力，比较研究其抗氧化活性，同时研究其吸湿性和保湿性等物理性质，拟为其抗氧化活性的利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪皮胶原肽、牛骨胶原肽 江西可生生化有限公司；牛皮胶原肽 三叶生物化工有限公司；鳕鱼皮(水分含量73.4%) 浙江海力生生物科技有限公司；驴皮胶(阿胶) 华东医药有限公司。

2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、2,2-联氮-双-(3-乙基苯并塞唑啉-6-磺酸)(ABTS) 美国Sigma公司；胰酶(4000U /g)、木瓜蛋白酶(3500000U/g) 南宁庞博生物工程有限公司；无水乙醇、三氯乙酸、铁氰化钾均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2100分光光度计 美国尤尼柯公司；L-8800高速氨基酸分析仪 日本日立公司；YC-015喷雾干燥器上海雅程仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鳕鱼皮胶原肽的制备

称取鱼皮，以鱼皮与水质量比为1:6的比例加水，于55℃恒温水浴中，调整反应体系pH值为6.0，加入质量分数0.2%的胰酶(以鱼皮湿质量计)，反应6h，升温至90℃灭酶20min，取出反应液并进行减压抽滤，将滤液喷雾干燥得到胶原肽成品。

1.3.2 驴皮胶原肽的制备

称取驴皮胶 (阿胶)，以阿胶与水质量比为1:8的比例加水，于55℃恒温水浴中，调整pH值为7，加入质量分数0.5%的木瓜蛋白酶(以阿胶计)，反应10h，升温至90℃灭酶20min，取出反应液并进行减压抽滤，将滤液喷雾干燥得到胶原肽成品。

1.3.3 胶原肽基本成分的测定

水分含量按照GB/T5009.3—2003《食品中水分的测定》进行，灰分含量按照GB/T5009.4—2003《食品中灰分的测定》进行，氨基酸含量按照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》进行。

1.3.4 肽含量的测定(三氯乙酸法)

称取2g(精确至0.001g)样品，加入10mL 质量分数15%三氯乙酸水溶液，混匀，4000r/min离心10min，弃去沉淀，采用GB/T5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》测定上清液中酸溶蛋白(肽和游离氨基酸总和)含量，游离氨基酸含量采用GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》进行，肽含量为酸溶蛋白含量减去游离氨基酸含量。

1.3.5 DPPH自由基清除活性的测定

按照DPPH比色法进行[6]。

1.3.6 ABTS+·清除活性的测定

按照ABTS+·清除活性法进行[7]。

1.3.7 还原力的测定

按照铁氰化钾法进行[6]。

1.3.8 吸湿性和保湿性的测定

按照参考文献[8]测定方法进行。

1.4 统计分析

采用Origin6.0 软件处理数据，数据以x±s表示。

2 结果与分析

2.1 胶原肽的主要成分由表1可见，除了鳕鱼皮胶原肽其他4种胶原肽的水分含量比较高(大于6%)，由此可见胶原肽具有很好的吸湿性。牛骨胶原肽的灰分含量相对较高，这与骨原料中含有较多的矿物元素有关，另外，5种胶原肽的肽含量均在70%以上，说明胶原肽以含有相对分子质量较小的肽为主。

表1 胶原肽的主要成分Table 1 Major composition of collagen peptides from different sources

2.2 胶原肽清除DPPH自由基能力分析

图1 胶原肽对DPPH自由基的清除率(n=3)Fig.1 Scavenging rates of collagen peptides from different sources on DPPH free radicals (n=3)

由图1可知，5种胶原肽对DPPH自由基的清除率呈质量浓度依赖关系，驴皮胶原肽具有较好的DPPH自由基清除能力，而牛骨胶原肽则相对较弱。5种胶原肽的IC50值大小顺序为驴皮胶原肽(0.63mg/mL)＜鳕鱼皮胶原肽(4.85mg/mL)＜牛皮胶原肽(9.75mg/mL)＜猪皮胶原

肽(11.91mg/mL)＜牛骨胶原肽(20.13mg/mL)。IC50值与清除自由基能力呈反比关系，驴皮胶原肽的IC50值仅为牛骨胶原肽IC50值的3.1%。

2.3 清除ABTS＋·能力分析

图2 胶原肽对ABTS+·的清除率(n=3)Fig.2 Scavenging rates of collagen peptides from different sources on ABTS+free radicals (n=3)

由图2可知，随着胶原肽质量浓度增加，其对ABTS+·清除率也呈增加趋势。在实验质量浓度范围内，鳕鱼皮胶原肽清除ABTS+·能力最强，驴皮胶原肽和牛皮胶原肽能力相当，而牛骨胶原肽显示最弱的ABTS+·清除能力。5种胶原肽的IC50值大小顺序为鳕鱼皮胶原肽(0.12mg/mL)＜牛皮胶原肽(0.28mg/mL)≈驴皮胶原肽(0.29 mg/mL)＜猪皮胶原肽(0.61mg/mL)＜牛骨胶原肽(0.94 mg/mL)。

图3 胶原肽的还原力随质量浓度变化曲线(n=3)Fig.3 Reducing powers of collagen peptides from different sources (n=3)

由图3可知，5种胶原肽的还原力均呈质量浓度依赖型，在胶原肽质量浓度10mg/mL时还原力(OD700nm)的顺序为：驴皮胶原肽(0.61)＞鳕鱼皮胶原肽(0.18)＞牛皮胶原肽(0.13)=猪皮胶原肽(0.13)＞牛骨胶原肽(0.11)，驴皮胶原肽显示了较强的还原力，而骨胶原肽则表现了较弱的还原力，在质量浓度10mg/mL时，驴皮胶原肽的还原力是牛骨胶原肽的5.54倍。

2.4 氨基酸组成分析

由表2可知，5种胶原肽中鳕鱼皮胶原肽的氨基酸总量最高，为93.29g/100g，另外4种陆上动物胶原肽的氨基酸含量较低，这可能与动物所处的生活环境及物种类别有关。甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸和精氨酸含量相对较高，据报道肽的抗氧化活性与其氨基酸组成有着紧密联系，除了脯氨酸鳕鱼皮胶原肽的其他组成氨基酸含量大于其他4种陆上生物的胶原肽，而鳕鱼皮胶原肽的抗氧化活性要弱于驴皮胶原肽，可能是水生生物和陆上生物胶原肽由于结构的差异，氨基酸组成和抗氧化活性的关系并不存在同比性。4种陆生动物胶原肽的组成氨基酸中，驴皮胶原肽中甲硫氨酸、酪氨酸及组氨酸的含量高于其他3种陆生胶原肽，而且这3种氨基酸的变化规律与前面所述抗氧化活性的变化趋势是一致的，同时也符合文献[9-11]报道寡肽中酪氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、组氨酸及丙氨酸含量与寡肽抗氧化活性有着对应关系。2.5胶原肽的吸湿性

表2 胶原肽的氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of collagen peptides from different sources

5种胶原肽在相对湿度(RH)43%和81%环境中的吸湿性如图4所示。5种胶原肽在RH81%中的吸湿性与RH43%相比差异不明显，在RH43%环境下胶原肽具有良好的吸湿性，可见胶原肽用于化妆品中在干燥环境下可起到良好的滋润作用。在上述两种湿度环境下，5种胶原肽均具有较快的吸湿速率，12h达到平衡。在RH81%和RH43%环境中，驴皮胶原肽的吸湿率最高，牛皮胶原肽的吸湿率最低，五者吸湿率的顺序为：驴皮胶原肽＞鳕鱼皮胶原肽＞牛骨胶原肽＞猪皮胶原肽＞牛皮胶原肽。

图4 胶原肽的吸湿性Fig.4 Moisture-absorbing capacities of collagen peptides from different sources

2.6 胶原肽的保湿性

图5 胶原肽在相对湿度43%环境中的保湿性Fig.5 Moisture-retention capacities of collagen peptides from different sources under 43% relative humidity

由图5可知，5种胶原肽在初始6h内保湿率大于100%，具有一定的吸湿能力，6h后随着时间的延长保湿率开始下降，24h趋于平衡，保湿实验中添加了样品质量分数为10%的水后，吸湿率反而快速上升，此现象可能是添加的水份在粉末之间以及粉末和水蒸气之间形成了液体桥等原因。驴皮胶原肽和鳕鱼皮胶原肽具有很好的保湿性，48h内保湿率大于100%，牛骨胶原肽次之，牛皮胶原肽和猪皮胶原肽的保湿率相近，而且两者随时间变化基本一致。

3 讨 论

胶原肽的抗氧化活性除了与组成氨基酸相关外，与其分子质量及其分布也有着密切的关系，Guo等[9]论证了皇浆蛋白水解物中分子质量小于1000D部分的抗氧化活性要强于其他两部分(1000～3000D和大于3000D)。作者前期报道[12]了5种胶原肽的分子质量分布情况，鳕鱼皮胶原肽、猪皮胶原肽、牛皮胶原肽和驴皮胶原肽分子质量主要分布于180～1500D，主要为寡肽，而骨胶原肽主要分布于500～25000D，主要为大分子蛋白质和多肽。

胶原肽是动物胶原蛋白的水解产物，主要由大分子蛋白质、肽、氨基酸及其他一些化合物组成，胶原肽抗氧化作用是一个复杂的反应过程，与不同自由基的反应存在不同的反应机理，还原力的大小综合反映样品抗氧化能力的强弱，与清除特定自由基的能力不存在必然联系。驴皮胶原肽、猪皮胶原肽、牛皮胶原肽、鳕鱼皮胶原肽及牛骨胶原肽5种胶原肽中，驴皮胶原肽具有较强的清除DPPH自由基的能力，IC50值为0.63mg/mL。鳕鱼皮胶原肽具有较强的清除ABTS＋·的能力，IC50值为0.12mg/mL。驴皮胶原肽具有较强的还原力，在10mg/mL下，OD700nm值为0.61。由此可见驴皮胶原肽是一种很好的抗氧化剂，本实验及前期实验[12]显示，驴皮胶原肽中的氨基酸含量、肽含量及分子质量分布与其他胶原肽并不存在显著差异，有关驴皮胶原肽具有的显著抗氧化性能机理有待进一步研究。

胶原肽在RH81%中的吸湿性与RH43%相比差异不明显，在RH43%环境下胶原肽具有良好的吸湿性。驴皮胶原肽具有很好的吸湿保湿性，在RH43%环境下，24h，吸湿率10.17%、72h，保湿率98.90%。可作为保湿剂应用于化妆品中。

[1]MIGUEL M, CONTRERAS M M, RECIO I, et al. ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a boving casein hydrolysate[J]. Food Chem, 2009, 112: 211-214.

[2]GIMENEZ B, ALEMAN A, MONTERO P, et al. Antioxidant and functional propertied of gelatin hydrolysates obtained from skin of sole and squid[J]. Food Chem, 2009, 114: 976-983.

[3]CUNEO F, COSTA-PAIVA L, PINTO-NETO A M, et al. Effect of dietary supplementation with collagen hydrolysates on bone metabolism of postmenopausal woman with low mineral density[J]. Maturitas, 2010, 65: 253-257.

[4]GRAHAM C, IRVINE A E, MCCLEAN S, et al. Peptide tyrosine arginine, a potent immunomodulatory peptide isolated and structurally characterized from the skin secretions of the dusky gopher frog, Rana sevosa[J]. Peptides, 2005, 26(5): 737-743.

[5]REES J A, MONIATTE M, BULET P. Novel antibacterial peptides isolated from a European bumblebee, Bombus pascuorum (Hymenoptera, Apoidea)[J]. Insect Biochem Molec Biol, 1997, 27: 413-422.

[6]JIA Jingping, ZHOU Yangang, LU Jjianzhang, et al. Enzymatic hydrolysis of Alaska pollack (Theragra chalcogramma) skin and antioxidant activity of the resulting hydrolysate[J]. J Sci Food Agri, 2010, 90: 635-640.

[7]林恋竹, 赵谋明. 反应时间对DPPH自由基法和ABTS+·法评价抗氧化性结果的影响[J].食品科学, 2010, 31(5): 63-67.

[8]季文静, 胡福良, 李英华, 等.蜂王浆酶解工艺及其产物吸湿保湿性能的研究[J].中国食品学报, 2009, 9(1):35-40.

[9]GUO Hang, KOUZUMA Y, YONEKURA M. Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein[J]. Food Chem, 2009, 113: 238-245.

[10]KAWASHIMA K, ITOH H, MIYOSHI M, et al. Antioxidant properties of branched-chain amino acid derivatives[J]. Chemical Pharmacol Bull, 1979, 27: 1912-1916.

[11]SUETSUNA K. Antioxidant peptides from the protease digest of prawn (Penaeus japonicus) muscle[J]. Mar Biotechnol, 2000, 1(2): 5-10.

[12]贾建萍, 周彦钢, 鲁健章, 等. 凝胶渗透色谱法测定胶原肽分子质量及其分布[J]. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(5): 968-969.

Antioxidant Activity, Moisture-absorbing and Moisture-retention Properties of Collagen Peptides from Different Sources

JIA Jian-ping，LU Jian-zhang，ZHOU Yan-gang，CHENG Min，YE Xiao-di，ZHENG Gao-li* (Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China)

Objective: To explore the antioxidant activity, moisture-absorbing and moisture-retention properties of collagen peptides from different sources. Methods: The antioxidant activities of collagen peptides from different sources were evaluated by determining their scavenging activities on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2’-azino-bis-2-ethybenz-thiazoline-6-sulfonic acid (ABTS+) free radicals and their reducing power. Results: The collagen peptide from donkey revealed the strongest scavenging activity on DPPH free radicals with IC50 of 0.63 mg/mL. The collagen peptide from Alaska pollack skin exhibited stronger scavenging activity on ABTS+free radicals with an IC50 of 0.12 mg/mL. Meanwhile, the collagen peptide from donkey also exhibited the strongest reducing power, which was 0.61 at the concentration of 10 mg/mL. The moisture-absorbing and moisture-retention rates of collagen peptide from donkey were 10.17% and 98.90% under the relative humidity of 43%. Conclusion: The collagen peptide from donkey can be used as a good additive in functional food and cosmetics.

collagen peptide；antioxidant activity；moisture-absorbing property；moisture-retention property

TQ936.16

A

1002-6630(2010)21-0169-04

2010-06-30

浙江省科技厅重大科技专项(2007F10031)

贾建萍(1975—)，女，助理研究员，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：jia_jp@163.com

*通信作者：郑高利(1963—)，男，研究员，博士，研究方向为药理、食品营养。E-mail：gaoli-z@163.com