ING4和H IF-1α在人脑不同级别星形细胞瘤中表达的研究

赵树鹏 牛光明 陶胜忠 张鹏远 宋 乐 尹先印 苏芳忠

郑州大学第二附属医院神经外科 郑州 450014

ING4基因是2003年发现的一种强的候选抑癌基因[1],它通过抑制肿瘤血管增生、调控细胞增殖和凋亡及细胞的接触抑制等抑制肿瘤细胞的生长。缺氧诱导因子-1α(H IF-1α)是一种重要的转录因子,能促进肿瘤的血管生成,对肿瘤迅速增长起着重要的作用。本实验通过对45例星形细胞瘤标本中ING4和H IF-1α蛋白检测,研究二者在星形细胞瘤发生和发展过程中的作用,为进一步揭示肿瘤的发病机制、诊断及治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 45例人脑星形细胞瘤均取自郑州大学第二附属医院神经外科2009-01～2009-07手术切除标本。男25例,女20例,年龄2～77岁,平均(41.8±18.3)岁。所有病例均为原发病例,术前未经放化疗。标本切除后中性福尔马林液固定保存,进行脱水、透明、浸蜡、包埋,蜡块连续切片,厚约4μm,HE染色后观察。按照2000年WHO中枢神经系统肿瘤分类标准[2],其中Ⅰ级 6例,Ⅱ级 18例,Ⅲ级14例,Ⅳ级7例。把24例Ⅰ～Ⅱ级设为低度恶性实验组,21例Ⅲ～Ⅳ级设为高度恶性实验组。11例正常脑组织为对照组,取自脑外伤、脑出血、脑动静脉畸形病人内减压者。

1.2 方法 应用免疫组化法检测,厚约4μm组织切片常规脱蜡,按S-P盒说明进行。以PBS代替一抗作为阴性对照,兔抗人ING4多克隆抗体和兔抗人H IF-1α单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司,S-P试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司,所用两种兔抗人抗体的终浓度为1∶100。

1.3 染色结果判定 ING4阳性表达以细胞核和或胞浆内出现棕黄色颗粒为准,HIF-1α表达于胞核或胞质,但主要是核表达,呈棕黄色。参考H iroshi等[3]提到的方法,随机选10个高倍视野,依照细胞着色密度和着色强度半定量评分: (1)染色细胞百分比:未见染色为0分,≤25%细胞染色为1分,25%～50%细胞染色为2分,＞50%细胞染色为3分; (2)依阳性细胞染色强度:未见染色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分,上述两者之和的总得分来判定结果,＞2分定义为阳性表达(+),≤2分定义为阴性表达(-)。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理,统计方法采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ING4的染色结果 ING4阳性染色细胞可见细胞核和(或)胞浆内出现棕黄色或褐黄色均质颗粒,主要位于胞核,也可见于脑胶质细胞、脑锥体细胞、血管内皮细胞及间质纤维组织。正常脑组织均见表达,明显高于星形细胞瘤中的表达,且在Ⅰ～Ⅱ级组中阳性表达率高于Ⅲ～Ⅳ级组,差异均有统计学意义。见表1。

表1 ING4蛋白在正常脑组织和星形细胞瘤中的表达

2.2 H IF-1α的染色结果 H IF-1α阳性表达主要定位于肿瘤细胞核,部分位于胞浆内,呈黄色或棕黄色的染色颗粒,以肿瘤坏死区边缘最为明显。正常脑组织中未见表达,明显低于星形细胞瘤中的表达,且在Ⅰ～Ⅱ级组中的阳性表达率低于Ⅲ～Ⅳ级组,经统计学处理,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 HIF-1α蛋白在正常脑组织和星形细胞瘤中的表达

2.3 ING4和H IF-1α之间的关联性 19例ING4表达阳性的星形细胞瘤中H IF-1α表达阳性8例,26例ING4表达阴性的星形细胞瘤中H IF-1α表达阳性24例,经χ2检验,两者呈负相关,相关系数r=-0.480。见表3。

表3 ING4蛋白和H IF-1α蛋白表达的关系

3 讨论

20世纪90年代,已认识到肿瘤是一种细胞周期调控异常性疾病,几乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效应均与细胞生命活动异常有关[4]。ING 4是生长抑制因子家族中的一个新成员,研究表明ING 4能够与P300相互作用促使P53乙酰化,诱导细胞发生G2/M期周期阻滞,抑制细胞生长和诱导细胞凋亡,且ING4还能抑制肿瘤血管的生成。ING4基因的缺失或突变,与多种肿瘤的形成有关。Suw on Kim等[5]通过比较基因组杂交技术(CGH)分析了ING4基因周围的缺失程度,发现T47D乳腺导管癌至少有两个拷贝的缺失。另外,Garkavtsev等[6]采用实时RT-PCR的方法对50例神经胶质瘤和5例正常对照脑组织中ING4基因mRNA水平进行检测,结果显示ING 4基因在神经胶质瘤中的表达下降,且与肿瘤恶性程度有关,级别越高表达水平越低。本实验结果与此一致。ING4蛋白在星形细胞瘤中表达降低,且与恶性程度呈负相关,提示ING4基因由于在星形细胞瘤中的缺失和突变,使肿瘤血管生成增多,细胞增殖加速和凋亡减少,是星形细胞瘤发病的关键因素。ING4有可能成为一个基因治疗的候选分子,通过对其表达的调控,进而有效地控制星形细胞瘤的发生发展。

H IF-1α是一种重要的转录因子,可以诱导肿瘤细胞耐受缺氧状态,促进肿瘤血管的生成。研究表明 H IF-1α对VEGF及多种糖酵解酶起着转录调控作用,并促进肿瘤生长,与恶性肿瘤的关系密切。Zagzag等[7]对30例不同级别的胶质瘤和10例血管母细胞瘤研究发现高恶性胶质瘤比低恶性者的H IF-1α表达强。同时Zhong等[8]对10例正常脑组织进行免疫组化染色,发现HIF-1α蛋白表达均为阴性。本实验检测结果与此相符,并发现H IF-1α蛋白在肿瘤缺氧坏死区边缘最为明显,且以高度恶性组多见,提示肿瘤细胞局部的缺氧使HIF-1α基因转录,可以对下游基因VEGF及多种糖酵解酶起调控作用,促进肿瘤血管生长,在肿瘤细胞增殖、浸润和转移过程中起重要作用。

近期有文献报道ING4可通过抑制 HIF-1α的活性,减少IL-8的表达,抑制肿瘤血管的生成,但具体机制尚不清楚,在星形细胞瘤中尚未见报道。2005年,Ozer等[9]发现ING 4水平和细胞内低氧状态下诱导产生的H IF-1α靶基因的表达呈负相关。结合本实验,在ING4阳性表达的星形细胞瘤标本中,HIF-1α趋向为阴性表达,呈负相关(r=-0.480)。由此我们可以推测可能存在这一机制,ING 4通过抑制H IF-1α的活性,使其失去对下游基因VEGF及多种糖酵解酶的调控作用和减少IL-8的表达,来减少肿瘤血管的生成,抑制肿瘤细胞的生长。总之,ING4的失活和H IF-1α的激活共同参与了星形细胞瘤的发生和发展过程,但二者之间的相互作用机制有待进一步研究证实。进一步认识ING4和H IF-1α在星形细胞瘤发病中的作用,可为肿瘤的治疗提供新靶点及新思路。

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