芽孢杆菌在沼虾养殖水体中益水作用的研究

张 云 宁丽军 谢晓晖 张妮静

目前，水产养殖业迅速发展，粗放式养殖正逐渐被半集约化和集约化养殖所取代，高密度、工厂化的水产养殖方式在世界各地的蓬勃发展很大程度上满足了人们对水产品的需求，解决了自然渔业资源相对短缺的矛盾，但同时水体环境也在发展过程中日益恶化，pH值不稳定，氨氮、硫化氢、亚硝酸盐、重金属含量超标，而水体中病原微生物的数量与氨氮、硫化氢、亚硝酸盐的浓度直接相关（余林娟，2004），像细菌性败血症等疾病的发生条件之一就是水体这些指标明显偏离正常值。同时，为了控制病害超量使用水产药物，甚至使用违禁药物，导致水产品安全性大大降低，形成恶性循环。为了保护渔业生态环境，提高可持续发展的效益，应用微生态制剂全程控制水体指标以保障安全生产已经成为许多养殖户的必然选择，尤其是对于养虾业，利润相对较高但投入大、风险大，一旦发病，后果相当严重，如何调养水质已经成为困扰养虾业的一个关键问题。微生物对疾病的预防和促进虾体生长的作用已经通过多年的养殖实践充分体现出来了（李勤生，1995），而芽孢杆菌的功用更是引起了水产学界的关注，这种益生菌是微生态制剂中常用的一种对养殖动物无毒、无害的细菌，在无公害水产品的生产、开发和生态环境保护中发挥着重要作用。芽孢杆菌在水中增殖后产生的许多胞外酶能把养殖水体、底泥中的淀粉、蛋白质、脂肪等有机质分解，从而达到维持养殖水生动物消化道微生物的生态平衡，降低养殖水体富营养化和减少病菌滋生，增强免疫力的作用。本文通过对江苏高邮地区养虾大棚不同时期提取的水样所做的多组分析试验，详细分析了芽孢杆菌在虾类养殖水体中的重要作用，而在生产中正是靠这些产品的应用才使轮虫、小球藻等生物饵料大量繁殖，藻相和菌相维持正常，减少使用一些副作用较大的农药和抗生素，极大改善了渔业的产品品质，从而提高了我国水产品在国际市场上的竞争力（王彦波等，2003）。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

选择江苏高邮司徒镇相邻且情况基本相同的两养殖池(1#和2#)，1#养虾池作为试验池（每隔5 d按量使用1次芽孢杆菌），2#作为对照池（不使用芽孢杆菌），分别在锅炉苗、大棚苗和大水苗放养后的3个晴天上午9:00定点0.5 m水深采取两池水样，并且标定序号1 h内进行试验，在整个试验期间两池保持相似的管理条件，且没有使用消毒剂，采样的同时检测池水透明度，所有测定均重复3次取平均值。

1.2 材料与器材

试验用粉剂浓缩芽孢杆菌（活菌含量5×109个/g，使用剂量200 g/（亩·m）由上海四季生物科技有限公司提供，氨氮显色剂、硫化氢显色剂及亚硝酸盐显色剂在实验室配制。

智能型水质分析仪（MR220，南京特安科贸有限公司生产）；显微镜（njf1-xs-212，北京中西远大科技有限公司生产）；血球计数板（71103，盐城市恒泰玻璃仪器厂生产）；塞氏盘（自制）。

1.3 试验方法

1.3.1 水体透明度的测定（塞氏盘法）

1.3.1.1 塞氏盘的制作

用铁皮剪刀剪取直径20 cm的圆白铁皮一块作为圆盘，中心打一个3 mm的孔。用锉刀沿铁盘外沿锉去快口和毛刺。在盘的一面过铁盘圆心画2条相互垂直的直径，间隔涂上白漆和黑漆。等漆干后，把一头扎有重物的绳子从未涂漆一面穿过圆盘中心孔，调整重物位置，使圆盘悬空时呈水平状态。然后在绳子贴近盘面处打一个结，使重物与圆盘成为一体。用黑漆在绳子上涂刷。以1 cm为基本单位作为长度标记，标记段取50 cm左右。

1.3.1.2 水体透明度的测定

采集水样前在两个养殖池各选择3处无直射光照射处作为测定对象，将塞氏盘缓缓放入水中（注意观察长度标记）。当圆盘下沉到恰好看不见盘面白色时，记录水面以下绳子长度。此数据即代表了水体透明度。测3次以求准确数值，把结果进行统计。

1.3.2 样品的处理及标号

将样品分别经粗过滤后，用小烧杯各量取15 ml，按时间及测量项目的不同依次标号，如3月12日所采水样全部标为1号，3月23号所采水样全部标为2号，依此类推，标记明确试验组与对照组。

1.3.3 氨氮的测定

1.3.3.1 纯水标定

在水质分析仪的氨氮测量位置上放入装满2/3纯水的氨氮比色皿，在主工作界面下，选择标定氨氮选项，进行纯水标定并且储存数据。

1.3.3.2 氨氮测定

用小烧杯量取15 ml的水样，用胶头滴管向水中加入氨氮显色剂0.8 ml。10 min以后，水样变黄并且产生一些絮状沉淀，经滤纸过滤后将溶液倒入比色皿内约2/3处，用擦镜纸吸干比色皿透光处的水珠后放到水质分析仪氨氮测试位置进行测量（侯树宇，2004）。重复以上步骤，每个样品测量3次。

1.3.4 硫化氢的测定

1.3.4.1 纯水标定

采用1.3.3.1节类似的方法。

1.3.4.2 硫化氢测定

将小烧杯里的15 ml水样先用胶头滴管加入10 ml硫化氢显色剂一号，再加入1 ml硫化氢显色剂二号，混合均匀后静置5 min后倒入比色皿内约2/3处再将比色皿擦拭干净后放到硫化氢测试位置开始测量。重复以上步骤，每个样品测量3次。

1.3.5 亚硝酸盐的测定

1.3.5.1 纯水标定

采用1.3.3.1节类似的方法。

1.3.5.2 亚硝酸盐测定

将小烧杯内的水样滴入1 ml配制好的亚硝酸盐显色剂，混合并静置5 min后倒入比色皿内约2/3处，擦干水迹后将比色皿放到亚硝酸盐测试位置重复以上步骤，每个样品测量3次。

1.3.6 血球计数板测量样品中有益藻及有害藻的数量

将血球计数板用擦镜纸擦净，在中央的计数室上加盖专用的厚玻片，将样品用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘，使溶液缓缓渗入，多余的水分用吸水纸吸取，稍待片刻，使藻类全部沉降到血球计数室内，计数时，使用16格×25格规格的计数室，按对角线位，数左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小格)的藻数（李卓佳，1998）（小球藻、螺旋藻等有益藻及裸藻、蓝藻有害藻分别计数）。当遇到位于大格线上的藻，一般只计数大方格的上方和右方线上的(或只计数下方和左方线上的)。对每个样品计数3次取其平均值，按下列公式计算每1 ml样品中所含的藻的个数。

16格×25格的血球计数板计算公式：

有益（有害）藻量（个/ml）=100小格内有益（有害）藻的数量/100×400×104。式中：400 指所有小格的总数；104指每个小格体积是0.1 mm3。

1.4 统计分析

数据使用SPSS 11.5软件及excel2003软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 水体透明度的变化曲线（见图1）

图1 水样使用芽孢杆菌前后平均透明度对比

透明度是反映养殖系统水质好坏的一个重要指标（张庆等，1999），一般来说，养殖虾池水体的透明度前中期以30～35 cm为宜，两池水样在这时期大体上都没有什么问题，但试验结果表明，水体透明度是随着养殖时间的延长有不断下降的趋势，在使用了芽孢杆菌之后试验组与对照组比较，变化幅度依次是－2.3%、－5.5%、+3.9%、－5.4%、－3.1%、－6.5%，对照组透明度基本都有明显的下降，尤其是在靠近中后期，或者水体中突然在短时间富营养化的时候，芽孢杆菌能维持透明度稳定而不至于使得养殖水发生浑浊或水华。由t检验可以知道，所测数据整体上说|t|=1.923＜t0.05(6)，则 P＞0.05，表明试验组与对照组透明度差异不显著，这主要是由于在第3 d天气变化导致芽孢杆菌作用效果减弱了，同时，水体溶氧等其它理化因子和浮游生物品种产生很大变化以致藻类大量死亡所致，对试验结果分析无碍。当去掉这一数值后，t值达到 11.2，远远大于 t0.01(5)，差异极显著（P＜0.01）。研究曲线同时说明，使用芽孢杆菌后水体的透明度整体上是在稳定中缓慢下降，这一点是非常重要的，没有使用芽孢杆菌的对照组透明度变化幅度明显大于试验组，在实际生产中，水质指标良好，稳定是第一位的，并不是透明度越大，提高透明度越快越好（刘春潮，1996），盲目增大透明度的行为会造成悬浮微生物少，水体自净能力弱，氨氮或亚硝酸盐含量过高，虾更易生病。

2.2 氨氮、硫化氢、亚硝酸盐的变化曲线

分别将9 d采集的水样进行分析得到数据变化曲线，见图 2、图 3、图 4。

图2 水样使用芽孢杆菌前后氨氮平均浓度对比

图3 水样使用芽孢杆菌前后硫化氢平均浓度对比

图4 水样使用芽孢杆菌前后亚硝酸盐平均浓度对比

氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮含量之和称为“无机氮含量”（辛福言等，2002）。从图2、图3、图4可以看出，整个养殖周期内，养殖虾池水体中无机氮含量变化较大，而且总体都呈现不断上升的趋势。同时，试验组与对照组相比变化显著，氨氮的下降幅度分别是 6.7%、－2.9%、16.5%、18.9%、11.3%、－3.7%、8.5%、7.6%、21.9%，硫化氢分别为 44.4%、－8.1%、15.25%、20%、8.8%、14.7%、13.2%、25.7%，28.4%，亚硝酸盐分别为 6.1%、15.5%、19.1%、－1.2%、17.5%、－14.9%、2.6%、9.9%、8.9%。在整个养殖期间，水体的氨氮值在0.16～0.32变化，统计分析表明，养殖40 d后试验组相对于对照组的氨氮浓度减少率为10.6%，对照组氨氮浓度与试验组经t检验，t=3.25小于 t0.01(9)，大于 t0.05(9)，因此 0.01＜P＜0.05，说明试验组与对照组在使用芽孢杆菌后效果比较明显，由于前中期取样没到氨氮高发期，只能部分代表芽孢杆菌的效果。试验组和对照组氨氮和硫化氢浓度在4号样品稍增后显著降低是因施肥过多、微生物分解不足导致，同时芽孢杆菌在养殖水体中繁殖为优势菌群需要一段时间（李健，2001）。亚硝酸盐对照组浓度一直快速上并维持在较高浓度趋势，而试验组浓度开始略有升高，而后相对下降，幅度逐渐增加，在养殖中期仍能保持正常水平，亚硝酸盐浓度相对于对照组减少率为11.6%，芽孢杆菌分解了底质沉积物，减少氧气消耗，促进了有益微生物的繁殖（陈秋红等，2004）。从图3可以看出，养殖池中硫化氢的变化趋势都有一个由低到高的阶段，体现了污染物在养殖池中的积累过程。对照组的硫化氢含量一直处于显著升高的状态，而试验组是缓缓升高且最高值仍低于养殖动物最适生长标准。试验组相对于对照组的硫化氢减少率为48.4%，对照组与试验组经t检验，t=2.689大于t0.05(9)，小于 t0.01(9)，因此 0.01＜P＜0.05，表明试验组与对照组相比差异显著，如果只是从中期数据来看这样的结果是有较大误差的，时间越长水体恶化越严重，芽孢杆菌发挥作用的空间越大，差异不是极显著来自前期相近数据的存在。这些数据整体表明芽孢杆菌对养殖水体氨氮、硫化氢、亚硝酸盐的去除有明显的功效，使用之后对于虾池水体环境有显著改良。

2.3 水样中有益（有害）藻数量对比曲线（见图5）

图5 水样使用芽孢杆菌前后有益、有害藻数量对比

从图5中能够直观的看出芽孢杆菌对水体藻类种类和数量的影响，与对照组比较，试验组小球藻、螺旋藻等有益藻保持较高水平，同时芽孢杆菌作用水体以后对蓝藻等有害藻有一定抑制作用，虽然没有定性检测，但是可以观察分析出来。试验中还观察到芽孢杆菌对防治养殖水体的富营养化具有一定作用，其作用原因可能是芽孢杆菌降低了水中C、N、P等元素的含量，使得蓝藻等因缺乏营养元素而无法大量生长繁殖，从而达到了控制水中有害藻类的目的。

3 讨论

本次试验是从实际的养虾池里获取水样，通过塞氏盘法、分光光度法和血细胞平板法，对比测定使用芽孢杆菌与否的水体透明度、氨氮浓度、硫化氢浓度、亚硝酸盐浓度、有益（有害）藻数量等数据，经过总结之后可以得到明显的结论：芽孢杆菌能有效提高养殖虾池水体透明度，减少氨氮、亚硝氮、硫化氢、蓝藻等有毒、有害物质对罗氏沼虾的危害，促进浮游生物生长，营造出适宜罗氏沼虾健康成长的水色。

目前，水产领域专家对芽孢杆菌的作用已经做了很多研究。沈锦玉 (2006)在养鱼水体使用芽孢杆菌B115制剂后，对养殖水体的溶氧和pH值无明显影响，但对氨氮、亚硝酸盐和硫化物均有大幅度降低，水体透明度明显增加。尹文林(2006)在蟹池和鱼池中分别加入芽孢杆菌作为水质改良剂发现，其对池塘氨氮、亚硝酸盐氮和硫化物有明显的降解作用，最大降解峰值出现在3～4 d，有效时间持续超过7 d。汤宝贵等(2007)研究也表明，芽孢杆菌能明显净化水质，降低鱼池和鳖池中的COD、亚硝酸氮和氨氮。但到目前为止还没有专门针对罗氏沼虾养殖过程使用芽孢杆菌状况的研究，由于罗氏沼虾与别的养殖对象在生活习性和日常管理方面存在一些明显差异，所以只要能够使养虾的水质维持指标正常，水色优良，藻类、菌类、浮游动物动态平衡，就能在很大程度上获得丰收的保证，而本次试验结果证明，芽孢杆菌正好能达到这样的目的，在整个试验过程中试验组的罗氏沼虾身体健壮，活力旺盛，肠道饱满，而对照组的虾则出现了不同程度的厌食、偷死等情况。因此，进一步研究芽孢杆菌在罗氏沼虾养殖水体中益水作用就显得极为关键和必要。

从整个养殖周期来看，在锅炉苗期间，总体上投饵很少，水体溶氧充分，藻相及菌相良好，透明度维持在较高水平，各种指标都会维持正常，但高密度长期养殖沼虾会造成大量的排泄物、残饵等有机物积累于水体，使池底表层中氧化层变薄，同时微生物缺乏导致分解不足，特别是气温变高时，水体中释放出了大量的氨、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质，造成虾池生物比例失调，水变浑发黑，从而影响沼虾的生长发育，引发虾体患病（Ho It JG，1994）。具体来说，沼虾水体中透明度随时间的延长在不断下降，氨氮和亚硝酸盐的含量都有上升趋势，但总体是呈现一个缓慢的过程。氨氮是沼虾池污染的重要因素之一，其危害的具体表现为：大量消耗水体溶解氧，使水体缺氧，与氯作用生成氯胺，还会加速水体的富营养化过程，诱发爆发性流行病或直接对沼虾产生危害，造成沼虾的大量死亡。氨氮的含量在沼虾养殖20～25 d时出现小峰值，亚硝酸盐的含量在30～35 d时才出现峰值，这说明肥水后对照组散失在水体中的蛋白质等有机氮不是立即被微生物分解脱氨的，而是积累到一定程度，待水体中异养菌大量繁殖到一定数量时，才被大量分解产生氨，造成水体中氨含量出现升高，而试验组由于芽孢杆菌的分解转化使得氨的含量升高并不明显，同理对照组亚硝酸盐的峰值比氨氮的峰值约延迟10 d，说明水体中的氮循环速度较慢，养殖环境中有机氮并未被及时去除，亚硝酸盐对沼虾具有很强的毒性，能把血红蛋白中的二价铁氧化为三价铁，使得血红蛋白中的亚硝酸盐还对沼虾的器官造成损害，严重影响沼虾的生长发育（Boyd，2000），使用芽孢杆菌的试验组亚硝酸盐仍然处于比较正常水平，但不会影响虾苗的生长。在养殖中期，由于水体有机物过多，局部供氧不足导致硫化氢开始增加至危险水平，芽孢杆菌明显抑制了增长的趋势，同时由于水体环境的改良，小球藻等有益藻数量也得到显著增加，虾苗所需的生物饵料保持充足。因此，在高密度的沼虾养殖过程中，适时加入芽孢杆菌等微生物制剂，能加快水体的物质循环，降低养殖水体中氨氮、亚硝酸盐等突然变化增加的风险，经常使用虾塘水体能保持稳定，水既不太“肥”也不易变“清”，水环境长时间处于良好水平。

在罗氏沼虾的实际养殖过程中使用芽孢杆菌是非常安全的，只有当芽孢杆菌浓度超过800 mg/l，才会因为菌体耗氧导致罗氏沼虾缺氧而死，因此，作为水质改良剂需视虾池水质情况每7 d泼洒全池1次，使用后及时开增氧机保证充足氧气，同时芽孢杆菌属细菌、消毒剂对其有杀灭和抑制作用，要在虾池消毒5～7 d后方可使用。芽孢杆菌的用量可根据实际水体大小、水色、底质好坏、水质因子超标与否等来灵活掌握用量，在养殖中后期，用量可适当加大。芽孢杆菌需要定期施用，保持其在罗氏沼虾养殖水体中拥有稳定的数量，才能收到满意的效果，获取最大的效益。

综上所述，芽孢杆菌对养殖沼虾的水体净化有一定功效，能有效地降低水中氨氮、硫化氢、亚硝酸盐含量，通过细菌的共生或互生作用，而迅速降解虾池中的有害成分。虽然芽孢杆菌不能总是沼虾池里的优势菌群，但是可以通过定期或不定期地使用高密度的高效菌液，使其在养虾水体中形成优势菌群。芽孢杆菌对沼虾池的净化作用需要对水域环境有一个适应过程（Austin，2000），如养殖户坚持使用会取得理想的养殖效果。