RNAi沉默STAT3基因联合化疗对人喉鳞癌细胞增殖的影响

郭慧 韩锦华 李东波 李晓明

信号转导和转录激活因子(Signal transducers and activators of transcri-ption, STAT)是一类由细胞因子、生长因子、非受体类酪氨酸激酶等细胞外信号激活的转录因子[1]，在基因治疗领域里，RNA干扰(RNA interference，RNAi)由于其具有高效性和高度特异性，是近年来基因组学研究的热点，正逐渐发展成为关闭特定基因功能的关键技术[2]。头颈鳞癌是常见的恶性肿瘤，针对其生长速度快、侵袭力强，对放化疗的敏感性低、抵抗力强的特点，本实验应用RNAi技术沉默STAT3基因，从对喉鳞癌细胞增殖的影响了解STAT3与喉鳞癌生物学行为和化疗抵抗关系及机理。

1 材料与方法

1.1 材料 重组质粒构建与试剂，我们的前期工作已经成功合成与纯化出重组质粒pGPU6/GFP/NeoshSTAT3(STAT3-siRNA),经DNA测序鉴定，重组质粒转染采用脂质体转染方法，人鳞状喉癌细胞株hep-2培养在完全RPMI medium 1640。MTT为Sigma公司产品。

脂质体Lipofectamine 2000由invitrogen corporation 生产，兔抗人STAT3抗体。

1.2 方法研究

1.2.1 细胞转染 HEP-2细胞常规培养至对数生长期，接种于培养瓶，细胞融合达40%～60%时分为五组进行转染(1)脂质体转染阴性对照组；(2)脂质体组；(3)DDP组；(4)脂质体转染STAT3-siRNA组；(5)脂质体转染STAT3-siRNA+DDP。其中DDP组加DDP(浓度4μg/ml[3])，STAT3-siRNA+DDP组先加STAT3-siRNA，6h后加DDP(浓度4μg/ml)。

1.2.2 细胞增殖状态检测 用MTT法。 接种HEP-2细胞于96孔板，贴壁后，无血清培养16～24h，实验组分别加入阴性对照质粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP(浓度4μg/ml)。第0、1、2、3天分别加入MTT 5g/L，继续培养4h，加入甲200μl，酶标仪测定490nm吸光度值，绘制生长曲线。

1.2.3 细胞周期检测 无血清培养细胞16～24h，实验组分别加入阴性对照质粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP。于24、48、72h分别消化细胞，PBS重悬，70%冰乙醇固定，37℃水浴1h，加入PI，4℃避光染色1h，流式细胞仪检测。

1.2.4 流式细胞仪检测蛋白的表达 无血清培养细胞16～24h，实验组分别加入阴性对照质粒，STAT3-siRNA，6h后加DDP。于24、48、72h分别消化细胞，PBS重悬，4%多聚甲醛固定，冰浴，分别加入相应的一抗、二抗，避光冰浴40min，上机检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件。数据比较采用方差分析、t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STAT3-siRNA增强了DDP对Hep-2细胞的增殖抑制作用 研究结果发现，随着时间的延长，DDP组表现出一定的增殖抑制效应，重组质粒组转染后24h开始表现出一定的增殖抑制效应，72h表现出明显的抑制效应，STAT3-siRNA重组质粒加化疗组能显著抑制Hep-2细胞的增殖活性，细胞出现了生长抑制现象，与STAT3-siRNA组、DDP组、脂质体对照组和阴性对照组相比，差异具有显著统计学意义(P＜0.05)。(见表1)

2.2 STAT3-siRNA增强了DDP对Hep-2细胞周期的阻滞作用 STAT3-siRNA与DDP作用于Hep-2细胞72h后，G1期细胞比率由54.1%上升至73.0%，S期细胞比率由32.5%下降至6.9%。STAT3-siRNA组、脂质体组、DDP组、阴性对照组细胞S期比例在20.9%～32.4%之间。STAT3-siRNA+DDP组73.0%的细胞阻滞于G0/G1期，高于其余四组(P＜0.05)，具有统计学意义。(见图1)

2.3 STAT3-siRNA与DDP对STAT3信号转导通路成员表达的影响 重组质粒与DDP作用于喉癌Hep-2细胞72h后，p-STAT3蛋白表达与活性下调，其靶基因产CyclinD1表达下降。经两样本均数比较的方差分析，重组质粒加DDP组p-STAT3、CyclinD1的蛋白表达荧光指数(1.276±0.195，1.336±0.142)明显低于其余四组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。(见表2)

3 讨论

化学治疗又称抗癌药治疗，目前临床上对于中、晚期恶性肿瘤常应用化疗辅助手术及放疗。顺铂是喉癌中晚期转移患者化疗的主要一线药物，因其单药总有效率不高，尤其以铂类为基础的联合化疗方案对喉癌的总有效率仍未见明显提高[4]，故寻找有效的方法和试剂提高顺铂治疗作用，对改善喉癌的疗效意义极其重大。

本次实验中应用流式细胞技术检测，我们观察到STAT3-siRNA重组质粒与DDP作用于Hep-2细胞72h后，p-STAT3蛋白表达与活性下调，其靶基因产物CyclinD1表达下降，而化疗组和阴性对照细胞中上述指标无明显变化，说明STAT3基因的沉默可以抑制STAT3的表达从而起到对顺铂增敏的作用。通常STAT3对细胞周期的调控作用主要表现为对基因Cyclin D1、c-Myc、Pim等的调控，过度表达Cyclin D1可以调节细胞周期前进，加快肿瘤细胞的增殖速度[5]。本次实验中，我们使用STAT3-siRNA重组质粒转染Hep-2细胞6小时后，加入4μg/ml浓度DDP，培养24h、48h、72h后，MTT法检测各组细胞的生存率，结果发现STAT3-siRNA重组质粒加化疗组能显著抑制Hep-2细胞的增殖活性，细胞出现了生长抑制现象，与STAT3-siRNA组、阴性对照组和脂质体对照组相比，差异具有统计学意义，说明Hep-2细胞在封闭STAT3基因后抑制了Cyclin D1的作用，由对顺铂耐药状态转变为对顺铂敏感。同时，流式细胞仪检测结果也显示，联合应用STAT3-siRNA重组质粒和化疗的细胞进入G0/G1期的细胞数较其余四组细胞有明显增加，同时S期细胞数明显减少；增殖指数PI下降，DNA合成期缩短，表明STAT3-siRNA与DDP联合作用于喉鳞癌Hep-2细胞后，细胞G1期阻滞明显，细胞增殖抑制作用增加。

表1 对喉癌Hep-2细胞的抑制率

图1 FCM was used to show the cell cycle of Hep-2 cells transfected with STAT3 siRNA+DDP after 72h(a:Control; b:Liposome; c:DDP;d:STAT3-siRNA; e:STAT3 siRNA+DDP)

表2 p-STAT3, Cyclin D1的表达

通过本次实验我们发现，STAT3-siRNA重组质粒具有增强化疗抑制肿瘤细胞生长的作用，是增强化疗敏感性的一个潜在的分子靶位点，有可能在不改变化疗药物剂量前提下，增加药物疗效。RNAi技术的治疗效果在逆转喉鳞癌化疗耐药中的有效性得到证实，加深了人们对化疗抗性基因水平机制的了解，为我们在基因水平上改变肿瘤细胞的化疗敏感性提供了线索。

[1]Levy DE,Darnell JE.STATs transcriptional control and biological impact[J].Nat Rev Mol cell biol,2002,3(9):651-662.

[2]Aimee LJ,Peter SL.Noise amidst the silence:off-target effects of siRNAs[J].TRENDS in Genetics,2004,20(11):521.

[3]王俊阁,李晓明,陈英会,等.信号转导及转录活化因子3反义寡核苷酸联合化疗调控喉癌细胞增殖与凋亡的分子机制[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2007,42(3):222-226.

[4]张梅春,赵子文,刘朝晖,等.重组人可溶性凋亡配体相关蛋白联合顺铂抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长[J].实用医学杂志,2007,23(3):301-303.

[5]Niu G.Constitutive STAT3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesis.Oncogene,2002,21(13):2000-2008.