糖尿病合并肺结核患者的转化生长因子 β1与sFas/sFasL的检测

孙志平 刘建辉 吕翠环

随着糖尿病发病率的增高及结核病的回潮,糖尿病合并肺结核的发病率也在逐年增加。本文观察糖尿病合并肺结核患者外周血转化生长因子 β1(TGF-β1)、sFas/sFasL和 T淋巴细胞凋亡的变化,意在探讨 TGF-β1、sFas/sFasL系统及 T淋巴细胞凋亡在糖尿病合并肺结核发生发展中的作用,为糖尿病合并肺结核早期干预治疗和判断病情提供实验室依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 正常对照组 10例,其中男 7例,女 3例;平均年龄 33岁。均为医院查体正常人员,经病史、查体、仪器与实验室检查排除糖尿病、肺结核病、冠心病等疾病。肺结核组 20例,其中男 12例,女 8例;平均年龄 43岁。根据临床表现,胸片及胸部 CT确诊 6例,痰菌检查确诊 14例。糖尿病组 20例,其中男 12例,女 8例;平均年龄 51岁。根据其空腹血糖、尿糖及糖耐量实验等确诊。糖尿病合并肺结核组 15例,其中男 9例,女 6例;平均年龄 55岁。根据其病史、胸部 X线检查,痰菌检查确诊。

1.2 实验方法 常规收集血清,ELISA法测定 TGF-β1及sFas/sFasL含量,实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。TGF-β1试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。人类sFas及sFasL ELISA试剂盒,购自上海森雄科技实业有限公司。抽取EDTA抗凝血,离心分离外周血单个核细胞(PBMC),使用染色缓冲液清洗 3次,加入抗 CD 3-PC7、抗 CD 4-PECy5和抗 CD 8-ECD一起在冰上染色 30m in,清洗 2次并在磷酸盐缓冲 0.9%氯化钠溶液重悬浮后,用结合 PE的 AnnexinV(AV)染色30min,溶解红细胞后稀释和固定,用 Coulter流式细胞仪分析,每个样本分析 50 000个细胞,凋亡结果以阳性细胞百分率(%)表示。

1.3 统计学分析 应用 SPSS 11.5统计软件,计量资料以±s表示,采用 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清 TGF-β1水平检测结果显示,肺结核、糖尿病和糖尿病合并肺结核 3组患者血清 TGF-β1水平均明显高于正常对照组(P＜0.01),糖尿病合并肺结核患者 TGF-β1含量也明显高于肺结核和糖尿病患者(P＜0.01)。见表 1。

2.2 外周血sFas及sFas L水平检测结果显示,肺结核、糖尿病和糖尿病合并肺结核患者外周血 sFas、sFasL含量均明显高于正常对照组(P＜0.01),糖尿病患者外周血 sFasL含量最高。糖尿病合并肺结核患者外周血sFasL含量明显低于糖尿病患者,若以 1 000 pg/m l为临界值,糖尿病合并肺结核 15例患者中,14例sFasL含量＜1 000 pg/ml,诊断糖尿病合并肺结核的敏感性为 93.3%(14/15),特异性为 90.0%(18/20);20例糖尿病患者中,18例 sFasL含量 ＞1 000 pg/ml,两者合计临床诊断符合率 91.43%(32/35),外周血sFasL水平下降可以作为判断糖尿病已或将发生肺结核的实验室指标。见表 1。

表1 4组血清TGF-β1和sFas/sFas L水平比较±s

表1 4组血清TGF-β1和sFas/sFas L水平比较±s

注：与正常对照组比较,＊P＜0.01;与糖尿病合并肺结核组比较,#P＜0.01

组别 sFas(ng/m l)sFas L(pg/ml)TGF-β1(ng/m l)正常对照组(n=10) 2.0±0.9 265±44 18±5肺结核组(n=20) 7.8±1.6＊ 618±106＊ 45±10＊#糖尿病组(n=20) 8.7±2.1＊ 1 468±312＊ 40±11＊#糖尿病合并肺结核组(n=15) 7.9±1.9＊ 565±200＊ 66±19＊F值 37.00 116.81 48.90 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 外周血T淋巴细胞的凋亡结果显示,患病组外周血 T淋巴细胞凋亡率均明显高于正常对照组,其中糖尿病患者 T淋巴细胞凋亡率最高,见表 2。

表2 4组患者淋巴细胞凋亡率比较%,±s

表2 4组患者淋巴细胞凋亡率比较%,±s

注：与正常对照组比较,＊P＜0.05,#P＜0.01;与糖尿病组比较,△P＜0.05

组别 CD3T淋巴细胞凋亡率CD4T淋巴细胞凋亡率CD8T淋巴细胞凋亡率正常对照组(n=10) 1.0±0.4 1.8±0.6 1.0±0.4肺结核组 (n=20) 2.6±1.4＊△ 3.2±1.2#△ 1.6±1.4#△糖尿病组 (n=20) 3.2±2.1# 4.7±2.0 2.3±1.8#糖尿病合并肺结核组(n=15) 4.3±1.8#△ 5.1±1.5#△ 1.4±0.5#△F值 17.14 27.60 9.45 P值 0.000 0.000 0.000

3 讨论

研究认为结核分枝杆菌侵入机体后,结核病的发生发展和转归不仅取决于结核分枝杆菌的数量和毒力,在很大程度上还取决于机体的免疫状态[1、2]。结核病患者通常存在免疫功能紊乱,但抗结核免疫主要是细胞免疫。TGF-β是一类多功能细胞因子家族,在人体内,TGF-β1参与炎症和细胞的损伤修复。在结核病中,TGF-β1主要发挥免疫调节作用,它既抑制 T细胞的反应,又能使巨噬细胞失活,可能是结核病免疫发病中的一个关键因素[3]。转化生长因子的过度表达与T细胞免疫紊乱有密切关系,TGF-β1能通过 Fas/FasL系统增强结核病 T细胞凋亡并调节其他免疫细胞的凋亡。TGF-β1还明显地抑制BCG诱导 T细胞的生长和 IFN-γ的分泌。有研究认为：通过 Fas/FasL系统介导的大量活性 T细胞的丢失可能增加了宿主对结核菌感染的易感性[4]。揭示其机制,将对临床诊断、针对性的免疫治疗有深远意义。

Fas/FasL系统在介导细胞凋亡方面起着重要的作用,糖尿病患者可能由于各种代谢因子刺激诱发了Fas/FasL信号系统,而导致细胞凋亡增多,其细胞凋亡增加可明显降低外周血 T淋巴细胞的活性及数量。另外 Fas/FasL系统介导的细胞凋亡降低了机体的细胞免疫功能在结核病发病机制中也起着非常关键的作用,尤其活性T淋巴细胞的凋亡增多直接降低了机体的细胞免疫功能,使结核分支杆菌免于 T淋巴细胞的杀伤作用,而结核分支杆菌感染巨噬细胞,表面FasL表达增加,也增加了Fas阳性 T淋巴细胞的凋亡,减少了被感染巨噬细胞的凋亡,胞内结核分支杆菌得以逃脱 T淋巴细胞的杀伤作用,发生免疫逃逸,使巨噬细胞内的结核分支杆菌得以长期生存,结核分支杆菌在体内长期生存而致病[4-6]。

本实验研究显示：糖尿病、肺结核及糖尿病合并肺结核患者较正常人外周血 TGF-β1及 sFas/sFasL含量均明显升高,而T淋巴细胞的凋亡明显升高。sFasL含量在糖尿病患者明显升高。糖尿病合并肺结核后外周血 sFasL含量又明显下降,提示在糖尿病合并肺结核后抑制凋亡因子增加,外周血环境不利于细胞的凋亡。在这种情况下,因过多的sFas与细胞毒T淋巴细胞表面的 Fas竞争,阻止其介导的细胞毒作用,结果使得被感染巨噬细胞凋亡减少,肺结核迁延不愈。在糖尿病或糖尿病合并肺结核患者,T淋巴细胞的凋亡增加主要系糖尿病自身代谢因素紊乱导致,故sFas的增多并不能明显减少活性T淋巴细胞的凋亡[7,8]。这可能是糖尿病合并肺结核难以治愈的原因之一。

实验中我们发现糖尿病合并肺结核患者外周血 sFasL含量明显低于糖尿病组,若以 1 000 pg/ml为临界值,我们认为sFasL含量小于 1 000 pg/m l可作为诊断糖尿病合并肺结核的敏感性指标,提示糖尿患者外周血 sFasL水平下降可能是糖尿病易发肺结核的机制之一,作为预测糖尿病将发肺结核的实验室指标,也可作为鉴别糖尿病是否已合并肺结核的指标。

本文研究结果提示,TGF-β1、Fas/FasL系统和 T淋巴细胞介导的细胞免疫可能参与了糖尿病并发肺结核的发病机制,糖尿病并发肺结核患者外周血 TGF-β1、sFas/FasL含量和 T淋巴细胞的凋亡的变化可以用以预测发病、判断病情、估计预后,具有重要的临床价值,另外外周血sFasL含量可作为鉴别糖尿病是否已合并肺结核的指标之一。本实验通过揭示其相关性,探讨了糖尿病患者合并肺结核的发病机制及免疫方式,将临床与基础学科、边缘学科紧密联系,使临床针对性的免疫治疗成为可能。

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