拟南芥18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径的研究*

汪启明,屠小菊,唐冬英,赵小英,刘选明†

(1.湖南大学生物学院;化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南长沙 410082; 2.湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128)

拟南芥18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径的研究*

汪启明1,2,屠小菊1,唐冬英1,赵小英1,刘选明1†

(1.湖南大学生物学院;化学生物传感与计量学国家重点实验室,湖南长沙 410082; 2.湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙 410128)

通过筛选以拟南芥蓝光受体隐花色素双突变体cry1cry2为遗传背景的激活标签突变体库,得到一株SCC98-D株系,该突变体具有早开花,下胚轴变短,并具有花瓣数目增加等表型,彻底恢复了cry1cry2的晚开花和长下胚轴表型.通过Tail-PCR的方法克隆得到SCC98-D突变体中激活标签插入位点的侧翼序列,通过对该侧翼序列测序发现插入位点在18srRNA的1751bp处,运用RT-PCR方法分析插入位点周围基因的表达,发现只有18srRNA的表达被激活,由此证实了18srRNA参与隐花色素介导的信号传导途径.

拟南芥;隐花色素;激活标签突变体;18s核糖体RNA

植物的蓝光受体对植物的生长发育起着非常重要的调控作用,拟南芥的蓝光受体包括隐花色素(cryptochrome)和向光素(phototropin)[1],隐花色素能够调控拟南芥长日照条件下的开花时间、光形态建成、气孔开放等一系列的生长发育过程[2-3],现代的植物分子生物学的研究结果发现,拟南芥体内主要发挥功能的隐花色素是CRY 1和CRY2[4-6].

近20年的研究发现,隐花色素能够通过与常数基因(Constans),光形态建成负调控因子COP1,钙调蛋白SUB1以及转录因子CIB1等蛋白相互作用,将信号传递给下游基因从而调控植物的多个生长发育过程[7-11].然而,对蓝光受体隐花色素调控下游基因表达的分子机制的了解仍不透彻[12],详细了解植物的光信号传递途径对于合理利用植物有益基因资源和开发生物能源有着非常重要的意义,所以,研究与隐花色素直接相互作用或者参与隐花色素介导的信号途径的基因是现代植物分子生物学的研究热点.

本文以隐花色素双突变体cry1cry2为实验材料,通过激活标签技术构建了T-DNA插入突变体库.通过筛选具有开花时间提前,植株矮化等表型的SCC突变体(sup press cry1cry2,抑制cry1cry2表型的突变体),并选取突变体库中表型为显性的突变体,命名为sup press cry1cry2-dom inant(SCC-D),同时采用 TA IL-PCR(Thermal asymmetric interlaced-PCR,热不对称巢式PCR)和RT-PCR方法对突变体进行分析,发掘被激活的基因,为阐明蓝光受体隐花色素发挥功能的分子机制奠定基础.

1 材料与方法

1.1 植物材料

拟南芥野生型(wild-type,W T)为col-4,哥伦比亚生态型;突变体cry1cry2:其遗传背景为 col-4;突变体SCC98-D是以cry1cry2为受体,通过插入激活标签筛选分离而来.

1.2 植物培养

拟南芥种子用体积分数为70%酒精处理30 s,然后用体积分数为0.1%升汞灭菌8m in,无菌水冲洗4～5次,均匀播于MS盐+质量分数0.8%琼脂的培养基上.4℃处理4 d后,连续照白光12 h,以促进种子萌发,并将植物转入22℃培养室,分别在长日照白光(16光照,8 h黑暗)和黑暗处理培养后观察苗期表型,以及在培养土中长日照白光(16光照,8 h黑暗)培养观察开花时间.本试验中用的蓝光、红光、远红光和白光光源分别为:LED-B(波长为470 nm,半幅宽为30 nm),LED-R(波长为660 nm,半幅宽为20 nm),LED-FR(波长为740 nm,半幅宽为25 nm)和白色荧光灯(飞利普).蓝光、红光和白光的光照强度用Li-250量子光度计测量.远红光的强度先用Li-250量子光度计测量,然后根据分光照度计测得的标准曲线进行估计.

1.3 质粒

激活标记载体pSKI015(见图1)由美国加州大学洛杉矶分校林辰涛教授提供.

图1 激活标签载体pSK I015示意图Fig.1 Diagram of activation tagging vector pSK I015

1.4拟南芥总DNA提取

液氮充分研磨植物材料,将75 mg新鲜材料样品中加400μL Buffer AP1,4μL RNase A,充分混匀;在65℃培养10 min,期间上下颠倒离心管2～3次;在130μL Buffer AP2,混匀,冰上放置 5 m in, 14 000 rpm离心5 min;将上清转入含2 m L收集管的过滤柱内,10 000 r/m in离心2min;将下清转入新的1.5 m L离心管内,加1.5倍体积的 Buffer AP3/E,颠倒3～4次,混匀;把溶液转入含2 m L收集管的吸附柱内,10 000 rpm离心1～2 min;如果一次过不完柱,可多次加样直至过滤完成,倒掉收集管中的液体;加500μL Buffer AW 1,10 000 rpm离心1 m in,弃下清;加 500μL Buffer AW 2,10 000 rpm离心 1 min,弃下清;重复上一步操作一次; 14 000 rpm离心3 min,将离心柱转移至1.5m L离心管内;加50～100μL Buffer AE至吸附柱滤膜上,室温静置 1～5 min,10 000 rpm 离心1 m in;将离心管中DNA溶液电泳检查后,置于-20℃保存.

1.5 T-DNA插入突变体侧翼序列的克隆

TA IL-PCR是一种比较成熟的扩增T-DNA插入侧翼序列的技术[13-15].本实验利用该技术来扩增突变体载体左臂的基因组DNA侧翼序列.根据pSKI015载体的序列,TAIL-PCR反应的3个特异性引物如下:LS1 5'-GACAACATGTCGAG-GCTCAGCAGGA-3';LS2 5'-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3';LS3 5'-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3'.其中 LS3离 T-DNA的左臂最近,这3个特异性引物的 Tm值较高,为60℃相邻.6个简并引物为AD1:5'-NTCGASTWTSGWGTT-3';AD2:5'-NGTCGASWGA NAWGAA-3';AD3:5'-WGTGNAG-WANCANAGA-3';AD4:5'-AG-WGNAGWANCAWAGG-3';AD5:5'-GNAGT-GWSANCAA-GA-3';AD6:5'-STTGNTASTNCTNTGC-3'.这6个简并引物的 Tm值较低,均为 45℃左右. TAIL-PCR的扩增条件为第1轮PCR:4℃,2 min;93℃,1 min;95℃,1 min;(94℃,30 s;62℃, 1min;72℃,2.5 min)5个循环;94℃,30 s;25℃, 3min;升温0.2 ℃/s,升至72 ℃(约需4 min);72℃,2.5min;(94℃,10 s;68℃,1m in;72℃,2.5 min;94℃,10 s;68℃,1 min;72℃,2.5 m in;94℃,10 s;44℃,1 min;72℃,2.5 min)15个循环;72℃,5min.第2轮PCR以第1轮的产物稀释50倍后取1μL为模板,扩增条件为4℃2m in;(94℃,10 s;64℃,1 min;72℃,2.5 min;94℃,10 s; 64℃,1 min;72℃,2.5 min;94℃,10 s;44℃,1 min;72℃,2.5 min)12个循环;72℃,5min.第3轮PCR以第2轮的产物稀释50倍后取1μL为模板,扩增条件为4℃,2 min;(94℃,15 s;44℃,1 min;72℃,2.5 min)20个循环;72℃,5min.3轮PCR的反应体系均为20μL.

1.6 总RNA提取及cDNA第1链的合成

1)采用安比奥公司生产的 RNA提取试剂盒,提取总RNA;

2)按照试剂说明书在总RNA溶液中加适量的Rnase(无DNase I)和10×Buffer,37 ℃水浴30min;

3)加水使溶液体积达500μL,然后加等体积氯仿混匀;

4)4℃,12,000 rpm 离心10m in,取上清,然后加2.5倍体积无水乙醇混匀,-20℃放置30 min;

5)4℃,12000 r/m in离心15min,然后用70%乙醇洗涤沉淀1～2次,真空干燥后将沉淀溶于适量的无RNase水,通过荧光分光光度计,进行样品浓度和纯度的测量,纯度合格的RNA样品-80℃保存备用.

6)合成cDNA第1链的逆转录反应体系为25 μL,首先在无 RNase的离心管中加约2μg的总RNA和Promega公司0.5μg Olig(dT)15,体系不能超过14μL,混匀,4℃短暂离心,70℃水浴5min后,立即冰浴冷却.短暂离心后,依次加入10×Buffer 2.5μL,Genview 公司 10 mM dNTPs 1.25μL, MBI公司RNaseA抑制剂25 u,Promega公司MM LV逆转录酶 200 u,加无RNase的水至25μL, 42℃反应 60m in后,70℃水浴10 min使酶失活,即得cDNA第1链.

1.7 半定量RT-PCR

半定量RT-PCR(Sem i-quantitative PCR)引物设计参照文献介绍的方法[16-17],根据半定量PCR产物长度限定在300～700 bp范围内以及PCR产物序列尽可能靠近目的基因序列的3'端的要求,引物的设计尽可能满足以下几个条件:引物最适宜长度为20～22 bp;最适宜退火温度为60～62℃;G+ C含量最好大于50%.根据上述要求,试验中采用Primer Premier 5.0软件对目的基因的PCR引物进行了设计,然后由上海生工生物技术有限公司合成,引物序列如表1所示.

表1 半定量PCR所用引物的序列Tab.1 Primers used in sem i RT-PCR

2 结果与分析

2.1 突变体SCC98-D的表型分析

通过筛选突变体库得到抑制cry1cry2表型的显性突变体(SCCD).本实验以突变体SCC98-D为研究对象,通过对其表型观察,发现在蓝光培养条件下该突变体与野生型相比,具有下胚轴变短(见图2)并且长日照条件下成花时间提前(见图3),花器官数目增加的表型(见图4).

为对突变体SCC98-D的表型变化进行定量分析,实验选取培养7 d的SCC98-D,WT和cry1cry2为材料,研究了不同光质光以及同一光质的不同光照强度下突变体SCC98-D下胚轴长度的变化,结果如图2所示:在白光或者蓝光下突变体SCC98-D的下胚轴比母本cry1cry2的要短,很好地抑制其遗传表型,恢复到野生型Col-4的表型,但是暗培养和红光培养条件下三者之间则无差异.

观察上述材料在长日照条件下生长的开花时间,并记录开花时间的差异.见图3,结果发现:突变体SCC98-D在长日照条件下开花时间提前,只有19 d就抽苔,比野生型Col-4的始花时间还要提前,而在短日照条件下始花时间无差异.由此说明,突变体SCC98-D 完全抑制了cry1cry2的开花表型,该突变体中被激活的基因极有可能是CRY信号传导途径的下游基因.

图2 突变体SCC98-D在不同光下的幼苗下胚轴分析Fig.2 Hypocotyl lengths of SCC98-D mutant seedlings in different lights

图3 突变体SCC98-D在长日照(LD)下早开花Fig.3 SCC98-D mutant early flow er under LD

观察花的发育情况,结果如图4所示:突变体cry1cry2的花器官的发育正常,与拟南芥野生型的数目和排列方式都一致;突变体SCC98-D花器官的数目增加,排列方式也不是对生,并且每朵花花瓣数目的增加并不一致,从5到9都有,但是大多集中在5枚花瓣.这种花器官的异常发育与突变体dbb1a的花器官突变表型又存在差异,突变体SCC98-D花器官的数目只有增加,而突变体dbb1a的花器官的数目有增加也有减少.突变体SCC98-D的表型说明,其体内被激活的基因可能参与隐花色素介导的光对拟南芥下胚轴伸长的抑制和光周期调控植物开花的信号传导,是CRY的下游基因.

图4 野生型(CoL-4)和突变体SCC98-D花的表型Fig.4 Flow er o f W T(Col-4)and SCC98-D

2.2 突变体SCC98-D中T-DNA插入位点及被激活基因的确定

为确定突变体SCC98-D的T-DNA插入位点位,采用TA IL-PCR方法克隆出T-DNA插入位点侧翼序列,图5(a)是TAIL-PCR产物的电泳检测结果,泳道 M 是分子 m arker;泳道 1,4,7分别为SCC91-D,SCC101-D和SCC98-D的总DNA为模板的TAIL-PCR的第1轮PCR产物,泳道 2,5,8分别为对应的TAIL-PCR的第2轮PCR产物,泳道3,6,9分别为对应的TAIL-PCR的第3轮PCR产物.由图4(a)可见,突变体SCC98-D为模板的TAIL-PCR的第3轮PCR产物有电泳条带,只略小于其第2轮PCR产物.该结果说明,扩增得到突变体SCC98-D的T-DNA插入位点的侧翼片段.

接着通过将克隆片段测序,并将克隆片段与拟南芥基因组序列比对发现突变体SCC98-D中的TDNA插入位点位于18srRNA(18srRNA)的3'端第1 751 bp处.为进一步验证T-DNA插入位点位,通过PSKI015载体上的特异序列与18srRNA序列设计上的引物,对各种材料的总DNA进行PCR检测,结果如图5(b)所示:泳道 M 是分子 marker,泳道1～3分别是以 SCC98-D,W T(Col-4)和cry1cry2的总PCR鉴定电泳,以突变体SCC98-D的DNA为模板的PCR产物中有1个1 000 bp左右的电泳条带,其与目的片段大小相同;而野生型和cry1cry2中均未扩增出目的条带.由此进一步证明突变体SCC98-D的T-DNA插在18srRNA的3'端第1 751 bp处,其T-DNA插入位点模式图如图6 (a)所示.

图5 SCCD突变体插入位点侧翼序列的获得Fig.5 Acquisition of f lanking genom ic sequence o f inserted site of SCCD mutants

为进一步挖掘突变体SCC98-D中被激活的基因,本实验通过RT-PCR方法分析插入位点相邻的基因在野生型Col-4,cry1cry2和SCC98-D中的表达差异,确定被激活标签PSKI015激活的基因.但是,由于18srRNA是18srRNA,相邻的基因非常少,大多是无功能的核酸序列,而仅有的基因也是是转坐子基因或没有具体功能的假基因,所以只选择检测A t3g3995,A t3g41979和18srRNA这3个基因.结果如图6(b)所示:SCC98-D中T-DNA插入位点所在的18srRNA基因在野生型中有表达,但在cry1cry2中表达量很少,而在SCC98-D中表达量很高;各突变体中A t3g3995和A t3g41979基因的表达量均无明显差异.该结果说明:突变体SCC98-D所具有的表型可能是由于18srRNA基因表达被激活而引起的.

图6 突变体SCC98-D的T-DNA插入位点及被激活基因分析Fig.6 The T-DNA insertion location and the actived gene in the SCC98-D mutants

3 讨 论

18srRNA是核糖体小亚基的组成部分,参与到植物体内蛋白质的翻译.此外,生物体中的某些基因的5'端非翻译区结合可以与18srRNA所包含的核糖体内进入位点(internal ribosome entry sites IRES)相结合,从而导致这些特异基因进行不依靠帽子结构翻译(Cap-independent translation).这种翻译机制可以帮助生物体在受到胁迫或紧急状态下得到需要的蛋白[18].通过分析18srRNA基因的互补序列,发现其1 750～1 765 bp区域为核糖体内进入位点,并且与受光诱导表达的锌指蛋白DBB1a基因5'端非翻译区中的一段序列一致.

此外,通过酵母双杂交实验发现隐花色素CRY2能与真核翻译的启始因子eif4E相互作用(未发表实验结果),而eif4E在真核生物蛋白翻译复合体中的关键蛋白,负责识别m RNA的帽子结构,并且在不依靠帽子结构的蛋白翻译过程也发挥着关键作用[19].因此推测,突变体SCC98-D抑制cry1cry2表型的功能可能与18srRNA基因介导的DBB1a基因表达相关.

本研究发现SCCD 98-1突变体能完全恢复cry1cry2的表型,且其中的18srRNA表达量上升,由此推测18srRNA可能通过参与不依靠帽子结构的蛋白翻译过程,调控光信号途径蛋白的表达,从而介入隐花色素介导的信号传递途径.然而植物蓝光信号传导途径非常复杂,而调控方式也极具多样性,因此18srRNA、隐花色素、eif4E以及 DBB1a之间详细的调控机制将有待于进一步研究,为全面揭示蓝光受体隐花色素介导的信号传递途径提供理论基础.

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A Study of 18srRNA Invovled in Cryptochrome-mediated Signaling in A rabidopsis

WANG Qi-ming1,2,TU Xiao-ju1,TANG Dong-ying1,ZHAO Xiao-ying1,LIU Xuan-ming1†
(1.State Key Laboratory forChemical Biosensing and Chemometrics,Hunan Univ,Changsha,Hunan 410082,China; 2.School of Biological Science and Technology,Hunan Agricultural Univ,Changsha,Hunan 410128,China)

SCC98-D was screened from an activation-tagging mutant library in the background of blue light-recep tor cryp tochrome doub lemutant cry1cry2 in A rabidopsis,which was early flowering,short hypocotyl and excess petalnum ber,and then the phenotype of late flowering and long hypocoty l in cry1cry2 was suppressed.The flanking sequence of inserted sitewas cloned w ith TAIL-PCR.The sequenced result of flanking sequence has shown that the T-DNA w as inserted in 1751 bp of 18srRNA.A fterwards,a transcriptional analysisof the gene around inserted sitewith RT-PCR demonstrated that the activated genewas 18srRNA.This study has identified that 18srRNA is involved in Cry-mediated signaling.

arabidopsis;cryptochrome;activation-tagging mutant;18srRNA

O613.52

A

1674-2974(2010)12-0066-06 *

2010-06-21

国家自然科学基金资助项目(30770200),教育部高校博士点基金资助项目(755228001)

汪启明(1982-),男,湖南衡阳人,湖南大学博士,湖南农业大学讲师

†通讯联系人,E-mail:sw_x lm@hnu.cn