知母中α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取及性质研究

杨秀芳, 陈 梅, 闫倩茹

(1.教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室， 陕西科技大学化学与化工学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

糖尿病是一种常见的有遗传倾向的内分泌系统疾病，预防和治疗糖尿病目前已成为医学界十分关注的课题[1,2].α-葡萄糖苷酶在机体的许多代谢过程中起着关键的作用,并与许多因代谢紊乱失调而引发的疾病有密切关系,如糖尿病、癌症、病毒感染等[3].因此，人们试图寻找合适的抑制剂用于控制和调节α-葡萄糖苷酶的活性，以期对有关疾病进行防治.目前研制的此类抑制剂有些已成为治疗糖尿病的新药，我国传统中医学治疗糖尿病已有2 000多年的历史,近年来国家确认了一批具有降血糖活性的中药,为筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物提供了良好的背景.

知母为百合科植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥根茎，现代药理研究结果表明知母具有清热泻火、生津润燥等功效[4].有研究报道知母水提物亦具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制剂作用[5].在前人筛选工作的基础上，作者进一步研究了知母总水提物的α-葡萄糖苷酶抑制作用，旨在从中提取分离出α-葡萄糖苷酶抑制剂并对其性质进行初步的研究.

1 材料与仪器

材料与试剂： pHS-25数显pH计(上海精密科学仪器有限公司)；UV-1700紫外分光光度计；GL21高速冷冻离心机； 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，购自Sigma；SPK-100超滤膜，购自中科院上海生化所；药材购自西安市中药材市场，其余试剂均为分析纯.

2 实验部分

2.1 相关试剂的配制

(1)pH 6.8、浓度为0.1 mol·L-1的磷酸缓冲溶液：将0.1 mol·L-1KH2PO4溶液67.5 mL与0.1 mol·L-1K2HPO4溶液82.5 mL混合.

(2)PNPG溶液：0.301 5 g PNPG溶于100 mL蒸馏水中，配成1 mmol·L-1的溶液.

(3)Na2CO3终止液：21.2 g Na2CO3溶于1 000 mL蒸馏水中，配成0.2 mol·L-1的溶液.

2.2 α-葡萄糖苷酶活性的测定

根据Tremblay等[6]的方法测定α-葡萄糖苷酶活性.取1 mmol PNPG 2 mL，pH 6.8磷酸缓冲溶液2 mL，在37 ℃水浴锅中保温5 min，再加入1 mL酶液，保温15 min，加入0.2 mol·L-1Na2CO3终止液5 mL，在400 nm的条件下测定其吸光度.用蒸馏水代替酶液作空白，其它步骤试剂一样，其中酶活力单位定义为：在37 ℃，pH 6.8的条件下酶液每分钟水解PNPG释放1μmol对硝基酚(PNP)的酶活力.抑制剂活力单位定义为：在相同的条件下，降低1个酶活力单位所需抑制剂的量.抑制百分比 =(抑制剂活力/酶活力)×100%.

2.3 知母中α-葡萄糖苷酶抑制活性成分的提取、分离及纯化

2.3.1 抑制活性成分HGI的分离纯化

称取知母切片120 g，按知母与水1∶4 w/v的比例浸泡，于60 ℃下浸提48 h.用12层纱布过滤，滤液在4 000 r/min下离心15 min，将上清液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,并测定各部分的抑制活力.对抑制活性最强的乙酸乙酯部分经活性炭脱色后，再用SPK-100滤膜超滤，被截留部分上CMC纤维素柱层析，紫外检测收集有抑制活性部分，真空浓缩干燥即得抑制剂HGI.

2.3.2 HGI纯度测定

将HGI溶液点样于乙酸纤维素薄膜上，两端用滤纸搭桥，电压150 V，电泳15 min，缓冲液为pH 12.2的硼酸盐缓冲液.0.5%甲苯胺蓝染色，1%乙酸脱色.

2.4 知母中抑制剂的动力学实验

2.4.1 温度对知母抑制剂的影响

分别在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃下测定知母中α-葡萄糖苷酶抑制剂的抑制活力(作相应空白对照)，反应终止时迅速冷却至室温.

2.4.2 pH对知母抑制剂的影响

分别配制pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.8、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0的缓冲溶液,在此缓冲体系下,测有抑制剂及无抑制剂两种条件下的酶活力.

2.4.3 抑制剂浓度对抑制效果的影响

分别选取抑制剂浓度为0、10、20、40、50、60、80、100 mg·mL-1，在同样温度、时间及pH条件下测定抑制活力.

2.4.4 抑制剂作用时间对抑制效果的影响

在试管中加入α-葡萄糖苷酶及抑制剂溶液(终浓度为40 mg·mL-1)，分别于37 ℃保温.在反应过程中，分别控制抑制剂作用时间为0、1、2、5、10、15、20 min，比较在不同时间下抑制剂的抑制效果.

2.4.5 抑制剂抑制类型的确定

表1 HGI的分离纯化

在一定抑制剂浓度条件下，分别加入底物(浓度为0.2、0.3、0.4、0.5 mmol·L-1)，测定酶活力.改变抑制剂浓度(分别为0、0.5、1 mg/mL),可得出一系列不同底物浓度条件下的酶活力，用双倒数作图法确定抑制类型.

3 结果与讨论

3.1 抑制剂的分离纯化

按2.3.1对知母提取物中的抑制成分进行分离纯化，各步骤分离结果如表1所示，经活性炭脱色后的活力单位为0.352 U/mL.再经超滤、柱层析后收集有抑制活性的流分，该组分浓缩干燥后得到α-葡萄糖苷酶抑制剂试样，其提取物抑制比活力为粗提液的2.4倍.

3.2 HGI乙酸纤维素薄膜电泳结果

图1 乙酸纤维素薄膜电泳结果

电泳时样品由负极向正极移动,染色得单一蓝色条带(见图1).HGI的成分鉴定:提取物HGI经茚三酮实验、双缩脲实验、三氯化铁实验、检测皂甙和黄酮类物质的实验结果均为阴性，只有Molish实验(糖及糖苷类物质的定性实验)结果呈阳性，表明HGI中不含蛋白质或酚类物质，因此HGI可能是含糖的大分子多聚物.

图2 温度对抑制效果的影响 图3 pH对酶活性和HGI抑制活性的影响

图4 抑制剂浓度对抑制效果的影响

图5 反应时间对抑制效果的影响 图6 抑制剂的双倒数酶动力曲线

3.3 抑制剂对温度和pH的稳定性

在不同温度下处理HGI溶液，测定其抑制活性，发现在35～100 ℃水浴10 min后抑制活性基本上不随温度的改变而变化(见图2)，表明HGI有很高的热稳定性.当HGI在pH 2.0～12.0范围内变动时,抑制活性也没有发生明显的改变(见图3),表明HGI的酸碱稳定性很好.

3.4 抑制剂的浓度对抑制效果的影响

由图4可见，加入抑制剂质量浓度为10 mg/mL时,抑制活力达到21.4%；加入60 mg/mL时，抑制活力为78%，表明HGI对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制活性.

3.5 HGI与α-葡萄糖苷酶作用时间对抑制活性的影响

HGI对酶的抑制作用迅速，结果如图5所示，说明抑制剂作用1 min，即可抑制90%的酶活性，以后基本不变.由此可见,HGI对α-葡萄糖苷酶有很高的亲和性，是一种活性很强的抑制成分.

3.6 抑制剂的作用类型

按照Dixon的方法测定该抑制剂的抑制作用动力学曲线，以1/[S]为横坐标，1/V为纵坐标作双倒数曲线，如图6 所示，由此可推测此抑制成分的抑制类型为竞争性抑制.根据竞争性抑制动力学方程可求得α-葡萄糖苷酶Km=4.57×10-4mol/L,Ki=3.86×10-3mg/mL.

式中:V-反应速度；Vmax-最大反应速度；Km-米氏常数；I-抑制剂浓度；S-底物浓度；Ki-抑制剂常数.

4 结论

本实验结果表明，知母水提液的乙酸乙酯萃取部分相对于其它溶剂对α-葡萄糖苷酶具有较高的抑制活性，对其进一步酶抑制作用的研究结果表明，知母中α-葡萄糖苷酶抑制剂在35～100 ℃具有较高的稳定性，对酸碱稳定性很好，抑制活性随着抑制剂用量的增加显著增强，且抑制作用迅速，在1 min内抑制率就能达到最大值，抑制类型为竞争性抑制.

参考文献

[1] 王 翼，张 旭.α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究进展[J].海峡药学,2009,21(9):4-6.

[2] 张捷平, 黄 玲, 施 红. 女贞子多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用[J].福建中医学院学报, 2009 ,19(1):35-37.

[3] 刘瑞丽, 丁美萍, 徐 雯, 等.α-葡萄糖苷酶抑制剂研究进展[J].药物生物技术,2009,16(4):388-392.

[4] 杨 云, 冯卫生.中药化学成分提取分离手册[M].北京:中国中医药出版社,1998:192-195.

[5] 高小平,张蔚瑜, 邹文俊, 等.中药提取物中α葡萄糖苷酶抑制剂的筛选[J].天然产物研究与开发, 2003,15(6):536-538. .

[6] 杨胜远,刘玉燕, 梁智群.β-葡萄糖苷酶产生菌的分离筛选[J].工业微生物, 2002,32(4):36-38.