228株结核分枝杆菌MLVA分型研究

同重湘，赵秀琴，马建军，刘志广，曹文静，杨永红，吕冰，姜元，万康林*

（1.甘肃省兰州市肺科医院检验科，甘肃兰州730046；2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室，北京102206）

228株结核分枝杆菌MLVA分型研究

同重湘1，赵秀琴2，马建军1，刘志广2，曹文静1，杨永红1，吕冰2，姜元1，万康林2*

（1.甘肃省兰州市肺科医院检验科，甘肃兰州730046；2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室，北京102206）

目的：通过多位点可变数目串联重复序列（MLVA）分型，了解甘肃省临床分离结核分枝杆菌菌株基因型情况。方法：选择标化的15个VNTR位点，对临床分离菌株DNA进行检测，DNA指纹图谱使用BioNumerics 4.5软件进行统计分析，得出聚类分析结果。结果：228株结核分枝杆菌被分为4大基因群，7个主要基因型，分别包含13（5.7%）、3（1.3%）、7（3.1%）、1（0.4%）、171（75.0%）、31（13.6%）、2（0.9%）个菌株；在株水平基因分型上，93（40.8%）株为独立基因型；其余菌株基因型分别包含2～10株结核分枝杆菌，共构成132个基因簇。结论：甘肃省临床分离结核分枝杆菌菌株存在丰富的基因多态性，MLVA方法具有较高的基因分型能力，可以满足结核分枝杆菌株水平DNA分型的需要。甘肃省临床分离结核分枝杆菌菌株主要为北京家族基因型菌株。

结核分枝杆菌；多位点可变数目串联重复序列；基因分型；北京家族基因型

目前，基因分型技术广泛应用于各种病原微生物的研究。结核分枝杆菌的基因分型鉴定，对结核病流行病学调查、结核病监测、传染源发现、传播途径、发病机制、耐药机制以及病原进化的研究均有非常重要的意义。随着分子生物学技术的飞速发展，基因分型方法在结核分枝杆菌分型中的应用逐步得到完善。MLVA方法是众多基因分型方法中较为成熟一种[1]，其基本原理是结核分枝杆菌基因组DNA存在独立的可变数目串联重复位点（variable number of tandem repeats，VNTR），VNTR具有高度多态性，在结核分枝杆菌中表现出株水平的特异性[2]。对多个VNTR位点进行检测，可以将菌株分为不同的基因型。MLVA分型方法操作简便，能够提供完整的数字信息，便于利用计算机软件进行统计分析，且稳定性和重复性高，在实验室内具有非常好的可比性。该方法曾用于北京、广西、西藏及陕西等省份结核分枝杆菌基因分型的研究，取得了很好的效果。据2007年统计，甘肃省结核患者31 057例，死亡106例，报告发病率及死亡率分别较上年上升10.2%和22.7%，在结核病防控、诊疗过程中，是否可借鉴其他省份的先进经验呢？首先要看我省临床分离的结核分枝杆菌在基因分型上与其他地方是否存在同源性，这将对我省结核病防治工作者在结核病防控、诊疗过程中制订防控策略提供理论依据。下面就兰州市肺科医院临床分离的228株结核分枝杆菌做一研究分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

入选的228株结核分枝杆菌菌株于2005年4月～2007年6月由甘肃省兰州市肺科医院分离提供，其中敏感菌株100株，均由初治病例分离；耐药菌株128株，均为耐多药菌株，其中107例由临床复治病例分离，21例由初治病例分离；结核分枝杆菌标准株H37Rv由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所实验室保存提供。

1.2 主要试剂

2xPCR-Mix（2倍PCR预混液）购自天根生物技术公司，100 bp DNA ladder（MBI Fermentas）购自上海生工公司，琼脂糖（Biowest）购自基因公司，引物由上海生工合成。

1.3 VNTR位点选择和操作步骤、方法

参见文献[3-4]。

1.4 数据分析

输入至电子表格的菌株VNTR数据，用BioNumerics 4.5软件进行分析，得出聚类分析图。

2 结果

228株临床分离结核分枝杆菌根据VNTR重复次数，经BioNumerics（Version3.0）软件聚类分析后被分为4大基因群，分别包含菌株23、1、202、2株菌，其中最大的基因群为北京家族基因型，共包含202株结核分枝杆菌。主要基因类型有7个，分别包含13（5.7%）、3（1.3%）、7（3.1%）、1（0.4%）、171（75.0%）、31（13.6%）、2（0.9%）个株菌；在株水平分类上228株结核分枝杆菌被分为132个基因型，其中93株为单菌株独立基因型，其余135株菌分属39个基因型，各包含2～10株菌。

3 讨论

本研究中笔者选取了228株2005～2007年甘肃省兰州市肺科医院临床分离的结核分枝杆菌不同分类菌株作为研究对象，菌株构成具有较强的代表性，基本包含了近年来本地区的流行菌株。结果表明，甘肃省主要流行株为北京家族（Beijing family）菌株，占绝大多数（202株，88.6%）。北京家族菌株在所选取的15个VNTR位点中，等位基因多态性由低到高排列分别为：ETR-C，ETR-B，MIRU23，ETR-D，Mtub30，MIRU27，MIRU39，Mtub39，MIRU10，ETR-A，MIRU40，ETR-E，MIRU26，MIRU16，Mtub21，其中前5个位点具有较高的一致性，其他位点可略有不同，差异主要集中在Mtub21、MIRU16、MIRU26、ETR-E等位点上。

在VNTR位点选择上，笔者兼顾了基因群的划分和基因型分辨能力的优化。分辨率低的位点在群分类上意义明显，分辨率高的位点在基因型分类上作用较大，有关VNTR位点分辨能力的研究可参考文献[4]。北京家族菌株广泛分布于中国及周边国家，欧洲及美洲分布较少。以往认为，北京家族基因型菌株的形成与耐药突变及BCG接种相关[5-7]，但近年来也有研究表明，北京家族基因型菌株与上述因素无相关性[8]，从该基因型菌株近年来的流行趋势分析，其易感人群广泛、传播速度快是其显著特点之一。因此，加强对该基因型菌株生物学特性的研究和流行病学监测，对今后结核病的防控具有极为重要的意义。

在株水平基因分型方面，228株结核分枝杆菌被分为132个基因型，其中93株为单菌株基因型，说明本研究选用的15个VNTR位点分型效果较为理想，具有较强的基因分型能力，有一定的应用价值。株水平分型在追踪结核病传染源、结核病暴发流行调查等方面具有非常重要的意义。

综上所述，本次研究使笔者对临床分离结核分枝杆菌基因型情况有了较为细致的了解，同时也为笔者今后的研究方向、制订防控措施以及临床诊疗提供了一定的理论依据，达到了预期目的。

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Analysis on the 228 Mycobacterium Tuberculosis with MLVA

TONG Chongxiang1,ZHAO Xiuqin2,MA Jianjun1,LIU Zhiguang2,CAO Wenjing1,YANG Yonghong1,LU Bing2,JIANG Yuan1,WAN Kanglin2*
(1.Department of Clinical Laboratory,Lanzhou Pulmonary Hospital,Lanzhou730046,China;2.National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,Beijing102206,China)

Objective:By Multiple locus variable numbers of tandem repeats(MLVA)genotyping,to analyze the genotypes of epidemic Mycobacterium tuberculosis strains in Gansu.Methods:15 standardized MLVA loci were used to type the clinical isolated M.tuberculosis strains of Gansu.Results were analyzed with BioNumerics 4.5.The dendrogram was summarized from the fingerprintings.Results:The result of MLVA showed that 228 strains of M.tuberculosis were classified 4 major genetic groups and 7 main genotypes.The largest genotype included 171(75.0%)strains,the others were 13(5.7%),3(1.3%),7(3.1%),1(0.4%),31(13.6%)and 2(0.9%)respectively.Farther particulars,93 strains(40.8%)were belong to unique genotype.The other strains contained 2-10 M.tuberculosis,all 132 geno-clusters.Conclusion:The bacterium strains of M.tuberculosi in Gansu has a rich nucleotide polymorphisms.MLVA is very useful to type the genotype of M.tuberculosi strains.Beijing family genotype strain is the dominant genotype in Gansu.

Mycobacterium tuberculosis;Multiple Loci VNTR analysis;Genotyping;Beijing family genotype

R378.911

B

1673-7210（2010）06（a）-097-02

2010-01-14）

国家自然科学基金资助项目（30771853）；甘肃省兰州市重点科研项目（07-1-94）

*通讯作者