骨髓间充质干细胞治疗股骨头坏死研究进展

戴双武，丁 帅，李章华

（1.深圳市宝安区石岩医院骨科，广东深圳 518108；2.武汉大学人民医院骨科，湖北武汉 430060）

股骨头坏死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是一种严重危害人类健康、致残率极高的常见疾病，常累及中青年，呈进展性和致残性发展，80%的患者在1～4年内进展为股骨头塌陷，最终因股骨头变形、毁损、髋关节剧烈疼痛而不得不行人工关节置换术。骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）具有良好的多向分化潜能、活跃的增殖特性、对外源基因的高效转染表达能力以及促进造血、在体外较易分离和培养等特性，较多地用于股骨头坏死的研究，显示了良好的应用前景。

1 股骨头坏死的机制

ONFH发病机制复杂多样，病因主要是创伤、应用激素、酗酒及结缔组织病因素等。微循环障碍是原发性股骨头坏死的共同病理机制，决定其病理演变的因素可概括为3个方面：病因、破骨细胞介导的骨吸收与骨的有效重建速度的平衡关系、生物力学作用。病因最终造成微循环损害，骨细胞、骨髓组织坏死、骨髓间充质细胞向成骨细胞分化能力下降，破骨细胞对失去保护的骨小梁吸收增强，骨小梁因而吸收变得稀疏、细小。另一方面，因骨小梁中的骨细胞坏死失去了矿物代谢功能，其机械强度随之下降。当应力传导时，骨小梁极易骨折，在骨坏死吸收的同时伴随修复，修复的强弱取决于供血状态及骨髓的功能状态。骨髓间质细胞分裂增生，在骨坏死区出现富含成纤维样细胞的结缔组织，毛细血管再生，成骨细胞及来自于骨髓间质细胞分化的成骨细胞合成骨基质，重建坏死的骨小梁，骨的吸收速度及新生骨的有效重建速度应保持一定的平衡关系，而这种关系最终由破骨细胞的活动、骨髓间质细胞向成骨细胞分化的能力及成骨细胞的功能状态决定[1]。总之，股骨头坏死的特征是股骨头缺血、坏死，随之出现修复反应，进而发生股骨头塌陷及髋关节退行性关节炎。

2 BM-MSCs的生物学特性

BM-MSCs来源于胚胎发育期中胚层，存在于骨髓组织中，较多用于ONFH的治疗研究中。在光学显微镜下BM-MSCs显示出类似成纤维细胞的外观，体积小，核浆比大；只有少数正在活跃地复制，细胞周期每个阶段的检控点和时间跨度均不明确；高比例的G0/G1期细胞暗示BM-MSCs具有高度的分化潜能；传代培养多数样本于P10代以后开始出现衰老现象。

BM-MSCs的主要生物学性状如下：细胞因子及生长因子有白细胞介素-1α、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-11、白细胞介素-12、白细胞介素-14、白细胞介素-15、LIF、SCF、Flt23 配体、GM-CSF、G-CSF、M-CSF；细胞活素及生长因子受体有：IL-1、RIL-7、RIL-4R、IL-6R、IL-7R、LIFR、SCFR、G-CSFR、IFNR、TNF-ⅠR、TNF-ⅡR、TGF-β1R、TGF-β2R、bFGFR、PDGFR、EGFR。 目前尚未找到 BM-MSCs的特异性标志物，通常以其较强的贴壁生长特性、不表达造血干细胞标志物（如CD14、CD34、CD45等）、形态似成纤维样细胞、具有多向分化潜能等特征来辨认。由于BM-MSCs可表达内皮细胞、表皮细胞和肌细胞等其他细胞的表面抗原，故常用 SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等来筛选BM-MSCs[2]。

3 BM-MSCs向骨、软骨的定向诱导分化

Tamir等[3]用一个细胞来源的BM-MSCs分别进行骨、软骨和脂肪的定向诱导分化，结果显示BM-MSCs具有多向分化能力。细胞因子与骨形成、骨愈合及骨重建有着密切的关系。这些物质有胰岛素样生长因子（IGFs）、成纤维细胞生长因子（FGFs）、转移生长因子-β（TGF-β）、血小板源生长因子（PDGF）和骨形态发生蛋白（BMPs）等。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）可刺激细胞分化和骨细胞基质合成。PDGF对骨细胞分化有着强大的作用。在兔胫骨缺损模型中，缺损处局部单纯注射PDGF可以提高伤处胶原的体积和密度。FGFs有多种调节作用，如细胞的有丝分裂、分化、蛋白酶的合成及受体的调节。有学者通过体外细胞培养发现碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对BM-MSCs有促进增殖作用[4]。TGF-β可刺激成骨细胞增殖，也是成骨细胞化学诱导因子和成骨细胞合成的抑制剂。实验表明，TGF-β可刺激兔颅骨缺损处成骨细胞的募集和增殖，从而导致骨愈合。BMPs家族由14个成员组成，它们可促进骨形成，而且能促进异位成骨[5]。李广恒等[6]将重组骨形态发生蛋白-4（BMP-4）加入体外培养的兔骨髓细胞内，发现其表达骨钙素和碱性磷酸酶。Lane等[7]做了重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）与骨髓修复鼠股骨缺损的实验研究，通过放射学和生物力学检测发现其无论在愈合率还是在生物力学性能上都比单纯自体松质骨组和单纯骨髓组优越。骨形成是多因子、多时相协调作用的结果，其详细调节机制尚有待进一步研究。

4 BM-MSCs与ONFH的治疗

目前对于股骨头缺血性坏死的发病机制尚未完全阐明。研究表明，股骨头坏死的发生与成骨细胞及骨髓基质细胞的功能下降有关。如Hernigou发现股骨头坏死患者的造血干细胞和骨髓基质细胞活性较正常人均有明显降低。Gangji等[8]比较了13例股骨头坏死，显示股骨头坏死患者转子部成骨细胞的增殖能力下降，结果提示，股骨头缺血性坏死可能是在多种因素的作用下，通过全身途径致使成骨细胞和骨髓基质干细胞的功能下降，进而导致股骨头再生血管和成骨能力降低。而BM-MSCs是具有成骨作用且能够自我复制的细胞，对促进股骨头坏死重建起到重要作用。Kocher等[9]通过实验证实，BM-MSCs或内皮前体细胞可以促进缺血模型的血流恢复。Kinnaird等[10]在给鼠缺血性后肢肌肉注射培养的骨源性干细胞后发现其可以促进侧支循环及肢体功能恢复，并且与血管生成有关的细胞因子（如VEGF、FGF-2、IL-6等）基因表达水平增高。BM-MSCs可诱导分化为成骨细胞也已在体内外实验中得到证实。可见通过BM-MSCs移植既有利于股骨头血液供应的恢复，又能提高局部成骨能力，从而促进坏死骨的修复，目前BM-MSCs的应用多与其他疗法联合应用[11]。

4.1 髓芯减压BM-MSCs移植

髓芯减压加BM-MSCs移植是临床治疗早期股骨头坏死的主要手段之一，已经有大量动物和临床实验报道都取得了良好的效果。刘长安等[12]在液氮造模后，采用髓芯减压并植入复合有自体BM-MSCs的明胶海绵，8周后钻孔区形成骨小梁结构，组织学显示钻孔区内充满新生骨小梁结构并成熟，小梁内骨髓组织填充。王江泳等[13]植入含有体外培养的自体BM-MSCs的明胶海绵和异体BM-MSCs的明胶海绵，8周时两组的钻孔区均出现骨小梁结构；骨小梁趋于成熟，可以看出同种异体和自体BM-MSCs移植均对兔股骨头缺血性坏死有良好的修复作用。

临床研究结果显示，骨髓干细胞移植治疗早期股骨头坏死，对缓解疼痛、阻止病变进展有较好的作用。Gangji等[14]对13例股骨头坏死患者18髋进行单纯髓芯减压和联合移植BM-MSCs髓芯减压的随机对照实验，60个月后实验组10髋中仅1髋行关节置换，而对照组8髋中有4髋不得不进行置换，生存分析表明，两组关节塌陷有显著性差异。Hernigou等[15]共治疗116例189髋，随访5～10年，平均7年，结果塌陷前期（Ⅰ、Ⅱ期）145髋中有9髋进行髓关节置换，塌陷后期（Ⅲ、Ⅳ期）的44髋中有25髋做全髋关节置换。结果显示，移植的细胞数量越多，疗效越好。郭小伟等[16]对Ficat分期为三期的20例患者进行自体周围血BM-MSCs移植，12个月随访显示，所有患者疼痛、关节功能显著改善、Harris评分与术前比较显著提高，且优于单纯髓芯减压术。汪学松[17]在病灶搔刮术后，直接自套管针内快速加压注入BM-MSCs到坏死区。治疗早期股骨头坏死27例，结果大部分患者疼痛、关节功能、X线片均有不同程度的改善。徐军等[18]应用髋关节镜及自体外周血BM-MSCs移植术，采用Harris髋关节评分评价优良率达94.7%，所有患者疼痛消失，行走正常，髓关节活动范围正常或接近正常，X线片示股骨头轮廓清晰，囊性变消失，为微创治疗ONFH提供了思路。上述研究说明股骨头髓芯减压BM-MSCs移植手术治疗早期ONFH具有损伤小、简便、准确、有效的优点，可改善关节功能。然而大规模、多中心样本试验长期疗效尚有待更多的临床观察进行验证。

4.2 BM-MSCs介入移植

近年来有学者采用介入方法移植BM-MSCs治疗ONFH，取得了很好的效果。杨晓凤等[19]分别向动物模型兔经DSA动脉注入BM-MSCs，移植后4周移植组兔右后肢股骨头区供血动脉较对照组股动脉明显增多。移植后12周右侧股骨头软骨、板层骨及骨小梁明显修复。季卫锋等[20]在DSA介入下向动物模型兔旋股内、外动脉插管分别注射BM-MSCs后，X线表现示骨质密度改变明显好转；病理组织学表现为空骨陷窝减少，成骨细胞增多，新骨形成；四环素荧光标记显示坏死修复区荧光带鲜亮，边界增宽。上述研究证明高选择性股动脉灌注BM-MSCs治疗股骨头坏死能加速兔股骨头的再血管化和再骨化进程，从而达到治疗ONFH的目的。

杨晓凤等[21]将导管超选择插入旋股内、外动脉及闭孔动脉，分次缓慢将自体BM-MSCs悬液注入动脉内。结果关节疼痛缓解85.7%，关节功能改善30.2%，旋股内、外动脉及闭孔动脉管径增粗，新生血管增多，股骨头区血液供应明显改善，2例18个月复查股骨头坏死区缩小，可见新骨形成。史沛等[22]采用介入方法将自体骨髓干细胞注入5例股骨头坏死患者治疗侧旋股内、外动脉及闭孔动脉内，1年随访结果显示，患者临床症状明显缓解，髋关节临床症状Harris评分显著提高，髋关节活动度无明显改变，未发生严重并发症。介入移植BM-MSCs治疗ONFH是一种安全有效、便捷的方法，还可以免除开放性手术的痛苦，为治疗早期ONFH开辟了新的思路。

4.3 基因转染BM-MSCs移植

将目标基因通过载体转入BM-MSCs内再与不同载体材料复合后植入股骨头坏死区治疗股骨头坏死，也是目前的研究方向，取得了许多令人振奋的结果。BMPs可促进骨形成，而且能促进异位成骨。陆斌等[23]利用人BMP-2基因转染的自体BM-MSCs复合多孔β-磷酸三钙材料治疗股骨头坏死，植入后1、2、3周BMP-2组在股骨头局部有BMP-2蛋白的高表达，有明显成骨；16周时坏死区被完全修复，且新骨体积明显大于对照组；BMP-2组股骨头形态规则，无塌陷，植入区松质骨标本的最大抗压强度、软骨下骨的最大抗压强度参数均与正常骨接近。Xiao等[24]联合rhBMP-2的BM-MSCs培养的支架材料干预，组织学也提示有正常骨修复，提示BMP-2基因转染的BM-MSCs是治疗ONFH的有效途径。张晔等[25]以脂质体介导Pcdna-Ang-1质粒转染兔BM-MSCs，与磷酸三钙（TCP）陶瓷复合，结果细胞与TCP材料复合生长良好。组织学检查见毛细血管生长及新骨形成活跃，电镜显示实验组成骨细胞和胶原纤维多于对照组，细胞器成熟，Ang-1修饰的BMSC预构人工骨也有助于股骨头坏死的修复。而陈超等[26]将hVEGF-165质粒转染BMSC与冻干松质骨作载体回植于兔股骨头坏死部位，在植入后2、4、8周对植入物进行形态学及组织学观察，结果显示股骨头坏死情况得到改善。杭栋华等[27]研究hVEGF-165基因转染的犬BM-MSCs移植、BM-MSCs移植对修复自体股骨头坏死的效果实验中，实验第2、4、8周骨小梁定量分析提示转基因的间充质干细胞移植组成骨修复好于单纯干细胞移植组；12周时，转基因间充质干细胞移植组中血管数量最多。余开湖等[28-29]报道，携带血管生成素基因（Ang-1）的BM-MSCs介入治疗不仅能促进毛细血管的生成，而且能定向进行骨分化，对ONFH有明显的修复作用。此外，温茜等[30]用重组方法产生重组腺病毒人肝细胞生长因子（Ad-HGF）转染BM-MSCs，转染后的BM-MSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF高表达，为其用于早期ONFH的治疗奠定了基础。利用生物技术将转染某些基因的BM-MSCs细胞用于治疗ONFH将是我们今后的研究方向之一。

4.4 联合填充材料BM-MSCs移植

BM-MSCs联合什么样的载体到目标区域也值得我们探索，并且也有很多学者做了相关研究。在支架材料的选择上，Fialkov等使用聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物（polylactic/glycolic acid copolymer，PLGA）作为体内研究的支架材料，徐晓良等使用骨形成蛋白/胶原/珊瑚复合人工骨用于股骨头缺损模型。由于PLGA降解产物酸性过强，对组织有副作用；胶原/珊瑚复合人工骨很难降解等缺点，限制了它们的使用。孙伟等[31]在兔双侧股骨头内骨缺损区填充纳米人工骨和BM-MSCs的复合材料。术后4周即有明显的成骨反应和新骨形成，填充纳米晶胶原基骨（nHAC）和BM-MSCs的复合材料组骨小梁结构形成，12周基本修复股骨头的骨缺损区，说明nHAC有较强的传导成骨作用，是修复兔股骨头骨缺损的良好移植材料，适合MSCs细胞黏附、生长、增殖和分化，有较强的组织相容性和适当的可降解性，能在降解过程中逐渐被新骨替代；复合BM-MSCs后能促进骨缺损的修复，对股骨头坏死的治疗有较大价值。付松等[32]则证实牛松质骨可以作为一种较好的载体应用于骨组织工程学。黄炎等[33]将小牛脱钙松质骨（DBCB）作为载体联合一定量的BMPs与不同浓度的含有BM-MSCs的单核细胞悬液治疗股骨头兔模型也取得了很好的效果。陈观华等[34]证实使用自体松质骨及BMP联合自体BM-MSCs治疗股骨头坏死实验兔效果良好。陆骅等表示作为BM-MSCs载体，目前冻干松质骨要优于羟基磷灰石。陈双涛等植入复合同种异体BM-MSCs的胶原蛋白海绵，同时植入腹壁浅动、静脉束，12周后缺损区可见成熟的骨小梁组织及新生骨髓。股骨头冠状截面的血管密度及新生骨小梁在骨缺损区所占的面积大，说明定向诱导的同种异体骨髓基质干细胞与腹壁浅动、静脉束相辅相成，联合应用可以快速、有效地修复股骨头坏死骨缺损，防止股骨头塌陷。目前对于局部联合材料移植BM-MSCs也是治疗ONFH的一个方向，但寻求组织相容性高、副作用少、便捷有效的材料依然值得探索。

5 目前BM-MSCs在治疗ONFH中存在的问题

BM-MSCs治疗早期ONFH是目前骨科研究热点，有很好的应用前景，但是也存在很多问题，如：①不同个体、不同疾病状态和不同部位的BM-MSCs数量和质量均可能有差异。因此，必须建立一套高效率的BM-MSCs体外扩增或活化技术，保证有足够数量的细胞满足临床需要。②移植治疗策略是BM-MSCs临床应用的关键。目前已经报道的治疗策略有BM-MSCs动员、静脉输入、靶器官动静脉血管介入、定位移植等，这些方法各有所长，针对不同的疾病采用哪种方法最合适还值得深入探讨。③目前有部分研究用不同类型的填充材料作为载体，但究竟哪种更加有利于BM-MSCs发挥作用且副作用小，值得我们继续研究。④临床疗效、体内可控性和安全性评价问题是BM-MSCs特别是转入某些基因后临床治疗需要明确的根本问题，虽然没有人报道BM-MSCs移植治疗的负面影响，但体外长期培养的BM-MSCs移植到体内后是否会发生突变和导致肿瘤或者畸胎瘤可能是BM-MSCs临床治疗中最令人担忧的问题，因此，必须建立可靠的技术方法和评价体系。⑤BM-MSCs治疗是一种有别于常规药物和手术治疗的新技术，需要有相应的技术规范和管理机制，保证BM-MSCs治疗技术健康发展。

尽管目前BM-MSCs在治疗股骨头缺血性坏死方面应用较少，但我们相信随着研究的深入，BM-MSCs的应用必将为广大股骨头坏死患者带来巨大的福音。

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