农业有机废渣固态发酵在食品工业中的应用

任 虹，曹学丽，徐春明，王巧娥

(北京工商大学化学与环境工程学院植物资源研究与开发实验室，北京100048)

农业有机废渣固态发酵在食品工业中的应用

任 虹，曹学丽，徐春明，王巧娥

(北京工商大学化学与环境工程学院植物资源研究与开发实验室，北京100048)

农业废渣含有多糖、纤维素、维生素、矿物质等可再利用物质，通过微生物固态发酵开发这些有机废渣生产高附加值代谢物，达到碳氮循环利用，同时解决了有机废渣堆放污染问题，具有良好的生态环境和社会经济效益。本文从微生物固态发酵方面综述了近年来利用农业有机废渣生产食品工业相关的高附加值微生物代谢物如酶(α－淀粉酶、果糖转化酶、菊粉酶、脂酶、果胶酶等)、有机酸(乳酸、柠檬酸等)及一些食品添加剂的研究进展。

农业有机废渣，固态发酵，食品工业，酶，有机酸，食品添加剂

Abstract:Agro－wastes contain several reusable substances such as soluble sugars，fibre，vitamin and mineral substances.Direct disposal of such wastes to soil or landfill causes serious environmental problems.Solid－state fermentation(SSF)for specific value－added products using these bio－wastes is favorable to both the carbonnitrogen recycle and the resolution of bio－wastes dump，which has become a very attractive alternative for the great economical and environment－friendly advantages.This paper reviews the reutilization of agro－wastes for the production of several metabolites relevant to food processing industry such as enzymes(α－amylase，fructosyl transferase，inulinase，lipase，pectinase ，etc.)，organic acid(lactic acid，citric acid)and some food additives using the SSF technique.

Key words:agro－wastes;solid－state fermentation;food industry;enzyme;organic acid;food additives

近年随着农业、果品种植业和生产加工业的迅速发展，农产品或果品加工后产生了大量的农作物麸皮、壳和秸杆以及各种果渣等有机废渣(Agrowastes or biological wastes)，这些废渣中含有大量糖、纤维素、维生素、矿物质等可再利用物质，如不采取措施综合利用，大量废渣在短时间内会腐烂变质，造成环境污染和资源的巨大浪费［1］。近年来，利用现代发酵及分离技术对这些资源进行深层次的研究开发，从而获得高活性、高附加值的天然功能产品，引起了各国学者的广泛重视，其中以有机废渣为基本培养基，选择合适的微生物菌株(酵母、真菌或细菌)进行固态发酵(Solid State Fermentation，SSF)，以获得高附加值的微生物代谢物，如α－淀粉酶、果糖转化酶、脂酶、果胶酶、乳酸、柠檬酸以及具有某些功能的食品添加剂已成为研究热点［2－3］。微生物有机废渣固态发酵不仅研发出大量的高活性的天然功能产品，使其在食品加工、营养保健方面发挥了重要的作用，同时也解决了农业废渣的环境污染问题，带来了巨大的生态效益、经济效益和社会效益［4－5］。本文着重综述最近几年农业废渣固态发酵在食品工业中的一些重大发展，范围主要限制在农业废渣培养基的特性以及利用这些废渣固态发酵生产的与食品业相关的高附加值微生物代谢物包括酶(α－淀粉酶、果糖转化酶、菊粉酶、脂酶、果胶酶等)、有机酸(乳酸、柠檬酸等)等活性物质的研究进展。

1 农业有机废渣培养基的特性

固态发酵是指在有机废渣固态培养基中进行的一种或多种微生物发酵的过程。培养基中虽然含水丰富，但几乎没有自由流动水，培养基基质不仅是微生物生长的固定附着物，还提供了微生物所需要的碳源、氮源、无机盐、水及其它营养成分，直接影响微生物发酵过程的物质代谢、气体交换和能量交换功能等［6－8］。由于有机废渣培养基大多不溶于水，在微生物发酵初期不易被利用，为了使底物更容易被微生物酵解利用，经常对底物进行化学或机械预处理，底物预处理的方法很多，包括汽爆、浸提、粉碎、裂解、研磨等机械处理及碱化学处理。必要时还需要外部添加一些成分。

微生物酵解有机废渣基质进行生长繁殖并产生代谢产物，受到基质本身的物理因素(底物颗粒大小、形状、空隙率、纤维含量、黏度、颗粒之间扩散率等)和化学因素(聚合度、疏水性、结晶度及电化学性质等)的影响。理想培养基基质必需满足以下基本条件［9－10］:a.有机废渣中应含有目标菌生长必需的碳源(纤维素、淀粉或其它糖)、氮源(氨基酸、多肽、脲等)及矿物质等。b.底物应为多孔基质(porous matrix)能提供较大的表面积，一般在103～106m2/cm3范围内较利于微生物的附着、快速生长和空气/氧气流通。c.有机废渣基质表面要有相对高的吸水力(water absorption index，WAI)，以保证基质的湿度或水活度(critical humidity point，CHP)，供微生物生长及代谢的需要。d.培养基基质呈颗粒状，有一定弹性，在发酵过程中能承受搅拌翻转等机械压力，不破碎、不连粘。其中基质底物颗粒的大小及湿度或水活度在固态发酵中对微生物的生长与活性最为重要。

2 目前已开发的适合固态发酵的微生物菌株及其产生的高附加值天然功能产品

利用微生物固态发酵转化农业废渣生产高附加值功能产品，利于碳氮再循环，具有能耗少、产品分离成本低、废液少、不存在二次污染等突出优点。合理优化控制发酵过程，既可减少资源浪费，得到结构优异的天然活性代谢物如各种代谢酶、有机酸、抗氧化剂、甜味剂、增色剂等食品工业相关的高附加值有效成分，同时又减小了对环境的污染。

2.1 有机废渣固态发酵生产酶

2.1.1 α－淀粉酶(α－Amylase) α－淀粉酶(EC 3.2.1.1)属胞外内切酶，能水解α－1，4糖苷键。淀粉酶广泛应用于酿造、果汁、糖浆、焙烤等食品工业。Francis等［11］利用曲霉 Aspergillus oryzae固态发酵谷物生产α－淀粉酶，发现在谷物固态培养基中加入Ca2+或 Tween－80后可增加 α－淀粉酶的活力。Krishna 和 Chandrasekaran［12］利用细菌 Bacillus subtilis固态发酵香蕉废渣生产α－淀粉酶，考察了培养基的水活度、pH、颗粒大小、热处理温度及时间、外加营养成分等因素对酶产量的影响，发现废渣颗粒大小(有效接触表面积)对酶产量有明显影响，颗粒大小为400μm 时酶产量最高。Ramachandran等［13］报道利用真菌Aspergillus oryzae固态发酵椰子油渣生产α－淀粉酶，直接用油渣发酵，每克干重油渣生产的酶量为1372U/gds，当油渣中加入0.5%淀粉和1%蛋白胨后，酶量增至3388U/gds，从而获得了固态发酵椰子油渣生产α－淀粉酶的有效方法。Sodhi等［14］考察了Bacillus sp.PS－7固态发酵麦麸、稻麸和玉米麸皮过程中废渣底物的含水量、孵化温度、底物颗粒大小以及添加的碳源、氮源和维生素对α－淀粉酶热稳定性的影响，发现在麦麸中添加1.0%(w/w)甘油、1.0%(w/w)大豆粉、0.1%(w/w)L－脯氨酸、0.01%(w/w)复合维生素B和1%Tween－40时酶的产量最高。

2.1.2 果糖基转移酶(Fructosyl transferase) 果糖转化酶(EC 2.4.1.10)用来催化蔗糖生成低聚果糖，低聚果糖在水果蔬菜中含量极低，它的甜度为蔗糖的0.3～0.6倍。低聚果糖能明显改善肠道内微生物种群比例，调节肠道内平衡，促进微量元素铁、钙的吸收与利用，防止骨质疏松症。近几年，低聚果糖的产品风靡日、欧、美等保健品市场。Sangeetha等［15］研究了利用曲霉Aspergillus oryzae CFR 202固态发酵各种谷物麸皮包括荞麦麸、燕麦麸、稻米麸、玉米穗轴、玉米壳、玉米胚芽及玉米全粉以及咖啡壳、甜菜渣、木薯渣对果糖转化酶产量的影响，发现在荞麦麸、玉米胚芽和咖啡壳废渣中添加酵母膏后酶产量较高，并通过硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和Sephadex G－200柱层析纯化得到该酶，SDS－聚丙烯凝胶电泳测得分子量为116.3kDa，最适反应温度为60℃，最适pH为6.0。

2.1.3 菊粉酶(Inulinase) 菊粉酶(EC3.2.l)又称为β－2，1－D－果聚糖酶或 β－果聚糖水解酶，是能够水解β－2，l－D－果聚糖果糖苷键的一类水解酶。许多菊科植物中含有丰富的菊粉(菊糖)，利用菊粉酶的作用可将菊粉转化为果糖、低聚果糖，在食品工业中具有重要应用价值和良好应用前景。Chen等［16］利用菌株Kluyveromyces S120固态发酵荞麦麸生产菊粉酶，发现在荞麦麸培养基中加入12.7%菊粉、10.8%玉米浆和1.6%(NH4)2SO4后，菊粉酶产量较稳定，酶活达409.8U/g。2009年，Sheng等［17］通过海洋酵母菌Cryptococcus aureus G7a固态发酵麦麸和米糠生产菊粉酶，并考察多种因素对酶产量的影响以寻找最佳发酵条件，发现培养基初始湿度为61.5%、菌株接种量为2.75%、麦麸与米糠用量比为0.42、发酵温度为29℃、pH为5.5时，发酵120h酶产量较高且稳定，活 力 达 420.9U/g。 Bender 等［18］利 用 菌 株Kluyveromyces marxianus NRRL Y－7571固态发酵甘蔗渣生产菊粉酶并研究其动力学，发现培养基成分的固/液比为1∶10、发酵温度为53℃、搅拌频率为150r/min时，发酵40min，可得到高产量的菊粉酶。

2.1.4 脂酶(lipase) 脂酶(EC3.1.1.3)催化水解长链脂肪，甘油三酯是其天然底物，脂酶广泛应用于食品饮食、洗洁剂、化妆品和医药生产中。Rao等［19］发现酵母菌Candida rugosa的椰子废渣固态发酵中废渣底物的碳氮比对脂酶的产量至关重要。后来Benjamin 等［20－21］比较了酵母菌 Candida rugosa 通过液体发酵与固态发酵椰子废渣对脂酶活力和产量的影响，发现固态发酵效果较好，可得到产量高且活性稳定的脂酶，同时发现在固态发酵过程中pH、孵化温度、气流量、底物成分，特别是当废渣底物中含有脂肪类物质能增加菌株脂酶的分泌。目前用于固态废渣发酵生产脂酶的微生物主要是酵母菌和真菌。

2.1.5 果胶酶(pectinase) 果胶酶(EC 3.1.1.11)催化植物果胶质降解成半乳糖醛酸和果胶酸，按其作用方式，果胶酶大致分为三类:a.原果胶酶(protopectinase)，将天然果胶转变为可溶性果胶。b.果胶聚半乳糖醛酸酶(pectin polygalacturonase)，断裂果胶或果胶酸中α－1，4糖苷键生成半乳糖醛酸。c.果胶甲酯水解酶(pectin methylesterase)，使果胶中甲酯水解，生成果胶酸。果胶酶广泛应用于水果的脱胶去皮、果汁和酒的澄清以及食用油的提取等食品工业中。近年用于固态发酵生产果胶酶的微生物菌株主要是曲霉属Aspergillus niger，有机废渣底物主要用荞麦麸、大豆皮渣、越橘果渣、草莓果渣、咖啡皮渣、可可茶渣、柠檬皮渣、柑橘皮渣、甜菜渣、甘蔗渣、苹果渣等。Bai等［22］利用 Aspergillus niger固态发酵生产高活性果胶酶，以甜菜根为碳源、味精生产废水为氮源和水源，同时加入Na2HPO4·12H2O 0.4g/L和KH2PO40.08g/L，发酵温度为30℃，空气相对湿度为75%～90%，发酵液经初分离得到的果胶酶粗提液即可预防黄瓜及番茄幼苗病虫害，这种方法既降低生产成本得到了果胶酶，又解决了环境污染问题。

2.2 有机废渣固态发酵生产有机酸

2.2.1 乳酸(lactic acid) 乳酸具有两种旋光异构体，人体存在乳酸脱氢酶可将丙酮酸转化为乳酸，乳酸在食品中应用广泛，乳酸还具有很强的防腐保鲜功效，在果酒、饮料、肉类、糕点、腌制菜的生产以及水果的贮藏中具有调节pH、抑菌、保持食品色泽、提高产品质量等作用。在医药方面广泛用作防腐剂、助溶剂、药物制剂、pH调节剂等;乳酸聚合得到聚乳酸，聚乳酸是良好的手术缝合线，能自动降解成乳酸被人体吸收，无不良后果;聚乳酸还可做成粘接剂在器官移植和接骨中应用。上世纪末人们就开始利用不同的微生物菌株Rhizopous oryzae和Lactobacillus paracasei固态发酵甘蔗渣、高粱渣、谷物麸皮等有机废渣生产乳酸。2005年 Naveena等［23］考察了菌株Lactobacillus amylophilus GV6固态发酵荞麦麸生产L－(+)乳酸的条件，发现在100g麦麸中添加0.9%蛋白胨、0.88%酵母膏、0.37%三柠檬酸胺、0.76%NaH2PO4·2H2O后可发酵得到36g L－(+)乳酸，转化效率较液体发酵高。2006年Rojan等［24］研究比较了Lactobacillus delbrueckii发酵木薯渣与甘蔗渣生产乳酸，发现在甘蔗渣中添加NH4Cl和酵母膏后在37℃发酵5d每克干重甘蔗渣可得到 249mg的L－(+)乳酸，但木薯渣产量较低。

2.2.2 柠檬酸(citric acid) 柠檬酸是食品和医药业最常用的有机酸之一，早年柠檬酸主要通过化学合成获得，但有机合成成本较高，后来利用曲霉Aspergillus niger液体发酵获得，但液体发酵受pH、温度、微量金属离子等发酵条件的影响大，为了降低成本、提高柠檬酸的产量，人们研究利用 Aspergillus niger进行固态发酵，发现固态发酵过程中菌株的选择和氧气的供给量是重要影响因素。Prado等［25］考察了通气量、发酵设备和曲霉菌株Aspergillus niger的代谢状况对柠檬酸产量的影响，利用菌株Aspergillus niger发酵苹果渣、菠萝渣、香蕉渣、荞麦麸、木薯渣等废渣时，需要较低的氧气通气量，动力学研究发现采用实验室用500mL锥型瓶摇床发酵，每千克干重甘蔗渣能生产309.70g柠檬酸，采用水平鼓状发酵罐(horizontal drum bioreactors)发酵，每千克干重甘蔗渣能生产 268.94g柠檬酸。Gutierrez－Rozas等［26］报道曲霉Aspergillus niger固态发酵有机废渣生产柠檬酸，培养基中葡萄糖含量影响较明显，但不受培养基中Fe2+、Mn2+、Zn2+等二价金属离子的影响，当培养基中葡萄糖起始浓度为400g/L时，每小时柠檬酸产量为1.35g/L，同时产生甘油、赤藻糖醇等副产物。

2.3 固态发酵生产其它食品添加剂

随着健康意识的提高，人们越来越崇尚绿色食品，源于天然植物或通过(微)生物转化的天然食品添加剂倍受青睐，目前利用某些细菌和真菌发酵有机废渣来生产某些甜味剂、乳化剂、保鲜剂、防腐剂和抗氧化剂等日益得到各国学者的重视。比如黄原胶(xanthan gum)是一种可溶性的胞外杂多糖，在食品、医药及化妆品中广泛应用，由于其无毒无害并具有良好的流变性，在食品中广泛用做乳化剂、稳定剂或增稠剂，Demain［27］报道全球每年约生产黄原胶30000t，创利 40800 万美元。Stredansky 等［28］发现利用细菌Xanthomonas campestris发酵燕麦麸、苹果渣、葡萄渣、柑橘渣生产黄原胶的产量高于传统的葡萄糖或果糖液体发酵产量，并通过NMR谱等技术分析其纯度，产品可用于商品销售。近年来各种各样天然来源的果香味添加剂也广受欢迎，越来越多地应用于食品中，Christen 等［29］考察菌株 Ceratocystis fimbriata发酵木薯渣、苹果渣、豆渣、咖啡壳和苋菜渣生产具有水果芳香味的挥发性化合物，发现苹果渣、木薯渣和豆渣发酵产物中芳香性化合物含量较高，其中咖啡壳发酵可产生具有菠萝香气的芳香物质，苋菜渣发酵效果不明显。Medeiros等［30］报道了利用菌株Kluyveromyces marxianus发酵大豆渣、木薯渣和棕榈皮生产单萜醇、异戊基乙酸酯、2，5－二甲基吡嗪和四甲基吡嗪来增加食品的果香味。目前用于有机废渣固态发酵生产芳香物质的常用微生物有真菌Neurospora sp.、 Aspergillus sp.、 Zygosaccharomyce rouxii、Rhizopus oryzae、Kluyveromyces marxianus 和Ceratocystis fimbriata以及细菌B.natto、B.subtilis等。

3 结语

农业有机废渣固态发酵通过可控制方式得到目标产物，近年来这种技术在医药、化工，尤其在食品工业中得到广泛应用，通过有机废渣固态发酵生产出了大量微生物酶、有机酸等高附加值天然产物，其中有些代谢产物的性能和产量高于传统的液体发酵产物。随着人们对废渣固态发酵机理的不断深入研究，农业废渣将被高效率转化为对人类有益的物质，既有利于自然生态系统再循环、减少资源浪费，又解决了环境污染问题，将带来巨大的社会效益和经济效益。

［1］Rodriguez CS.Exploitation of biological wastes for the production ofvalue－added products undersolid－statefermentation conditions［J］.Biotechnol J，2008，3(7):859－870.［2］Rodriguez CS，Angeles SS.Application of solid － state fermentation to food industry ［J］.J Food Engineering，2006，76(3):291－302.

［3］Papinutti VL，Diorio LA，Forchiassin F.Production of laccase and manganese peroxidase by Fomes sclerodermeus grown on wheat bran ［J］.J Ind Microb Biotechnol，2003，30(3):157－160.

［4］Graminha EBN，Goncalves AZL，Pirota RDP，et al.Enzyme production by solid－state fermentation:Application to animal nutrition［J］.Feed Sci Technol，2008，144(1):1－22.

［5］Bhanu P，Padmaja GVS，Siva KV.Statistical optimization of process variables for the large－scale production of Metarhizium anisopliae conidiospores in solid－state fermentation ［J］.Bioresour Technol，2008，99(6):1530－1537.

［6］Pandy A.Recent process developments in solid － state fermentations［J］.Process Biochemistry，1992，27(2):109－117.

［7］Pandy A.Solid－state fermentation［J］.Biochem Eng J，2003，13(1):81－84.

［8］Ooijkaas LP，Weber FJ，Buitelaar R，et al.Defined media and inert supports:theirpotentialassolid－state fermentation production systems ［J］.Trends Biotechnol，2000，18(8):356－360.

［9］Suryanarayan S.Current industrial practice in solid state fermentation for secondary metabolite production:the Biocon India experience［J］.Biochemical Engineering Journal，2003，13(2):189－195.

［10］Raimbault M.General and microbiological aspects of solid substrate fermentation［J］.Electron J Biotechnol，1998，1(3):174－188.

［11］Francis F，Sabu A，Nampoothiri KM，et al.Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the production of α－amylase by Aspergillus oryzae ［J］.Biochemical Engineering Journal，2003，15(2):107－115.

［12］Krishna C，Chandrasekaran M.Banana wastes as substrate for α－amylase production by Bacillus subtilis(CBTK106)under solid－state fermentation ［J］.Applied and Microbiology Biotechnology，1996，46(2):106－111.

［13］Ramachandran S，Patel AK，Nampoothiri KM，et al.Coconut oil cake－a potential raw material for the production of α－amylase［J］.Bioresource Technology，2004，93(2):167－174.

［14］Sodhi HK，Sharma K，Gupta JK，et al.Production of a thermostable α－amylase from Bacillus sp.PS－7 by solid－state fermentation and its synergistic use in the hydrolysis of malt starch for alcohol production ［J］.Process Biochemistry，2005，40(2):525－534.

［15］Sangeetha PT，Ramesh MN，Prapulla SG.Production of fructosyl transferase by Aspergillus oryzae CFR 202 in solid－state fermentation using agricultural by－products［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，65(5):530－537.

［16］Chen X，Wang JH，Li DS.Optimization of solid－ state medium for the production of inulinase by Kluyveromyces S120 using response surface methodology［J］.Biochemical Engineering Journal，2007，34(2):179－184.

［17］Sheng J，Chi Z，Yan K，et al.Use of response surface methodology for optimizing process parameters for high inulinase production by the marine yeast Cryptococcus aureus G7a in solid－state fermentation and hydrolysis of inulin［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2009，32(3):333－339.

［18］Bender JP，Mazutti MA，Di Luccio M，et al.Extraction of inulinase obtained by solid state fermentation of sugarcane bagasse by Kluyveromyces marxianus NRRL Y －7571［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，2008，149(3):195－203.

［19］Rao PV，Jayaraman K，Lakshmanan CM.Production of lipase by Candida rugosa in solid－state fermentation.I:determination of significant process variables［J］.Process Biochemistry，1993，28(6):385－389.

［20］Benjamin S，Pandey A.Optimization of liquid media for lipase production by Candida rugosa［J］.Bioresource Technology，1996，55(2):167－170.

［21］Benjamin S，Pandey A.Lipase production by Candida rugosa on copra waste extract［J］.Indian Journal of Microbiology，1996，36(4):201－204.

［22］Bai ZH，Zhang HX，Qi HY，et al.Pectinase production by Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant disease resistance［J］.Bioresource Technology，2004，95(1):49－52.

［23］NaveenaBJ，AtltafMd，Bhadrayya K，etal.Direct fermentation ofstarch toL(+)lacticacid in SSF by Lactobacillus amylophilus GV6 using wheat bran as support and substrate:medium optimization using RSM ［J］.Process Biochemistry，2005，40，(2):681－690.

［24］Rojan P，John K，Madhavan NA，et al.Solid－ state fermentation for L－lactic acid production from agro wastes using Lactobacillus delbrueckii［J］.Process Biochemistry，2006，41(4):120－126.

［25］Prado FC，Vandenberghe LPS，Lisboa C，et al.Relation between citric acid production and respiration rate of Aspergillus niger in solid－state fermentation［J］.Engineering in Life Science，2004，4(2):179－186.

［26］Gutierrez－ Rozas M，Cordova J，Auria R，Revah S，Favela TE.Citric acid and polyols production by Aspergillus niger at high glucose concentration in solid state fermentation on inert support［J］.Biotechnology Letters，1995，17(2):219－224.

［27］Demain AL.Small bugs，big business:the economic power of the microbe ［J］.Biotechnology Advances，2000，18(6):499－514.

［28］Stredansky M，Conti E.Xanthan production by solid state fermentation［J］.Process Biochemistry，1999，34(6):581－587.

［29］Angeles N，Corzo G，Farres A，et al.Microbial lipase production on a polymeric resin［J］.Biotechnology Techniques，1998，9(11):597－600.

［30］Medeiros A，Pandey A，Christen P，et al.Aroma compounds produced by Kluyveromyces marxianus in solid－state fermentation on packed bed column bioreactor［J］.World Journal Microbiology Biotechnology，2001，17(8):767－771.

Application of solid－state fermentation of agricultural wastes in food industry

REN Hong，CAO Xue－li，XU Chun－ming，WANG Qiao－e
(Laboratory of Plant Resource Research and Development，Beijing Technology and Business University，Beijing100048，China)

X712

A

1002－0306(2010)08－0396－04

2009－10－22

任虹(1967－)，女，博士后，副研究员，研究方向:天然活性产物化学。

国家自然科学基金(30572279＆30973631);国家高技术研究发展计划(863计划)(2007AA092400)。