高效毛细管电泳技术在中药指纹图谱研究中的应用Δ

江尚飞，杨元娟，何 静，蒋红艳，唐 倩，兰作平

（重庆医药高等专科学校药学系，重庆市 400030）

中药指纹图谱的建立对中药质量进行整体描述和评价，对控制中药及中药制剂的质量，促进中药现代化都具有很重要的意义。指纹图谱作为中药及其制剂的质量控制方法，目前已成为国际共识，各种符合中药特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立[1]。

目前，用于中药成分分析的方法很多，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描（TLCS）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）和高效毛细管电泳（HPCE）等色谱法以及紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、质谱（MS）、核磁共振（NMR）和X-射线衍射等光谱法[2]。其中HPLC法最常用。但用HPLC法进行中药成分分析往往分析时间长、分离效率低，而且色谱柱容易被污染，并且色谱柱上沉积的污染物经常以杂质峰的形式出现，影响分析结果，对于含极性成分较多的中药，其“指纹”的特征不强[3]。

毛细管电泳（CE），亦称HPCE，是近十几年来发展很快的一种高效分离分析技术，即离子或荷电离子以电场为驱动力，在毛细管中按其淌度或分配系数不同实现分离的一类电泳分离新技术，具有分离效率高、速度快、灵敏度高、所需样品少、溶剂消耗少、成本低、前处理简单、抗污染能力强、应用范围广等特点[4]。CE按分离模式的不同分为以下9类：毛细管区带电泳（CZE）、胶束电动毛细管色谱（MECC）、毛细管凝胶电泳（CGE）、毛细管等电聚焦电泳CIEF）、毛细管等速聚焦电泳（CITP）、毛细管电色谱（CEC）、亲和毛细管电泳（AEC）、毛细管电动色谱（EKC）、非水相毛细管电泳（NACE），其中CZE和MECC应用较为广泛[5，6]，但近年来NACE发展很快，应用越来越多。目前，各类CE方法已经广泛应用于中药及中药制剂指纹图谱的研究[7，8]。

1 HPCE技术在植物类中药指纹图谱中的研究应用

孙国祥等[9]以10个不同产地的玄参建立了HPCE指纹图谱。玄参用水回流提取后，用50 mmol·L-1硼砂溶解制得样品，以5-羟甲基糖醛（5-HMF）、哈巴俄苷、肉桂酸作对照品，用石英毛细管柱，以50 mmol·L-1硼砂溶液作缓冲液，在运行电压12.1 kV、电流约0.108 mA、紫外检测波长280 nm条件下进行分析，获得不同产地玄参药材的指纹图谱，并具有良好的重现性与精密度，按共有峰出现率f i＝100%计，确定玄参药材中的10个中药指纹峰。并以对照品对不同产地玄参的HPCE指纹图谱进行评价，得出3产地质量完全合格，4产地含量明显偏低，3产地含量明显偏高，为玄参药材及其制剂的质量控制提供了新的依据。杨宏涛等[10]采用MCC法，以30 mmol·L-1硼砂+10 mmol·L-1十二烷基硫酸钠（SDS）为缓冲液，运行电压为12 kV，紫外检测波长为205 nm，以10个不同产地药材的电泳图谱建立了苦参的对照毛细管指纹图谱。建立的苦参CE数字化指纹图谱具有较好的精密度和重现性，准确简便，测定费用低且方法学考察符合规定的标准，可作为控制苦参药材内在质量的有效手段。Yu K等[11]在对黄芩CE研究中，优化条件，以黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素作为控制标准建立黄芩毛细管指纹图谱，对34个不同产地的黄芩进行质量分析控制，方法快速、精密、可靠，对所有来源的药材进行了质量评价。

刘金丹等[12]模仿工业化用乙醇回流提取水沉再进一步纯化对甜瓜蒂进行成分分析，以50 mmol·L-1硼砂（含体积分数为5%的乙腈溶液）作为缓冲溶液，在12 kV电压下操作，紫外检测波长为228 nm，以10个不同产地药材的电泳图谱建立了甜瓜蒂CE指纹图谱，确立11个共有峰，结合双定性双定量相似度评价法较好地实现了对甜瓜蒂药材质量的全面数字化控制，并为其它色谱指纹图谱方法研究及中药生产质量控制提供有益参考。有人用甲醇超声提取莲子心制备供试样品，采用CZE模式，压力进样10 s，分离电压为30 kV，柱温为25℃，检测波长为282 nm，运行缓冲液由100 mmol·L-1硼酸、100 mmol·L-1KOH按4∶2的比例配置（pH 8.90），以莲心碱为对照品分析得到不同来源的莲子心CE图谱，从中选定15个共有峰作为构成莲子心提取物指纹图谱稳定的特征峰，建立HPCE指纹图谱。相似度均在0.900～1.000之间，其指纹图谱整体面貌基本一致，为莲子心提取物的定性鉴别及内在质量评价提供了新的方法和依据。蒋迎道等[13]用醇提取山茱萸成分，乙醚脱脂，经水饱和的正丁醇反复萃取，并脱水得山茱萸有效部位配制50 g·L-1的水溶液，以pH 9.5、50 mmol·L-1的硼砂溶液作为缓冲液，操作电压为22 kV（+）→（－），进样压力为34.5 kPa·s，柱温为30℃，200 nm紫外检测条件下，获得最优条件下的山茱萸CZE和MECC化学特征指纹图谱，并具有良好的重现性与精密度，建立了满意的山茱萸HPCE指纹图谱，为相关的药效研究和生产过程控制提供了依据。曹敏等[14]采用50 mmo·L-1硼酸盐+10 mmol·L-1磷酸盐为缓冲液，以内径50 μm、有效长度50 cm的CZE测定了栀子药材指纹图谱，探讨以栀子内在质量控释的标准。

李玉兰等[15]采用CZE法，以50 mmol·L-1硼砂水溶液+100 mmol·L-1硼酸水溶液（2∶1）为背景电解质缓冲溶液，运行电压为20 kV，紫外检测波长为254 nm，流体力学进样10 s（压力，5×103Pa），对28批小花鬼针草进行分析，建立小花鬼针草的CE特征图谱，方法速度快，并且精密度、重复性及稳定性试验中，各特征峰的相对迁移时间的相对标准偏差（RSD）小于6%，相对峰面积的RSD小于10%，可作为小花鬼针草的CE指纹图谱，可用于快速鉴定小花鬼针草。孙国祥等[16]以40 mmol·L-1硼砂溶液为缓冲液，压力进样6 s，在电压17 kV、温度25℃条件下建立了不同产地金银花的HPCE指纹图谱，可作为金银花内在质量的控制标准。

2 HPCE技术在动物类中药指纹图谱中的研究应用

雒翠霞[17]等用10个不同来源地的南方大斑蝥60℃干燥粉碎后，用75%乙醇回流提取，水沉除杂，减压回收乙醇后残渣再用水定容作供试液。在紫外检测波长265 nm、灵敏度0.005 AUFS、运行电压12 kV、电流约60 mA、缓冲液为50 mmol·L-1硼砂溶液条件下，重力进样20 s，高度8 cm进行HPCE试验，测定10个不同产地斑蝥药材指纹图谱。以尿苷峰为参照物峰，按出现率100%确定10个共有峰。并对这些信息特征进行数字化评价[18]，与对照指纹图谱比较，其定量相似度全部合格。并且对斑蝥的翅、足、头和躯干制备样品溶液，以同样条件进行试验，其指纹图谱与对照指纹图谱的定性相似度分别为0.971、0.882、0.855，比率定性相似度分别为0.923、0.906、0.827，说明斑蝥头、足、翅与全虫相比，化学成分分布较为相似，三者存在并不影响斑蝥整体质量，故斑蝥炮制时没有必要去头、足、翅。刘萍等[19]分别用天然牛黄、人工牛黄、人胆结石及一种牛黄伪品在冰浴中研磨成浆状，高速离心后取上清液作供试样品，在30 mmol·L-1硼酸盐缓冲液（pH 8.5）、电压20 kV、温度20℃、紫外检测波长200 nm、重力进样、时间5 s条件下对每个样品检测3次，测定各个样品的峰数、出峰时间、峰面积，以样品的电泳迁移时间（T）对峰面积（AU）作图，并以该样品所有特征峰的峰面积相加、峰高相加分别为100%，计算各个样品的峰面积比值（A%）、峰高比值（H%），用Tris-甘氨酸、碱性蛋白、酸性蛋白作对照品，以Tris-甘氨酸、碱性蛋白、酸性蛋白提取液中特征峰的迁移时间、峰面积比与峰高比作比较，很好地区别出天然牛黄与人工牛黄、人胆结石、牛黄伪品。

3 HPCE技术在中药制剂指纹图谱中的研究应用

中药制剂成分更加复杂，生物活性成分的研究、控制已经引起全球科学家的重视。班丽娜等[20]研究了西瓜霜制剂的HPCE方法，用制备的西瓜霜制剂作供试样品，压力进样，20 mmol·L-1缓冲液（pH 8.5），分离电压为25 kV，分离温度为25℃，检测波长为206 nm，7 min内有效测定了西瓜霜喷剂中多种有效成分的含量，精密度高，检测快速。闫滨等[21]用HPCE法测定了克心痛滴丸中阿魏酸的含量，分辨能力强，能较好地把阿魏酸与干扰物分离，精密度高，重现性好，有机溶剂消耗少，测定成本低。丁娟娟等[22]将CE法应用在动物类中药及富含氨基酸的中药制剂的质量控制中，这提供了新的试验手段，在中药有效成分的分离检测中显示出较好前景。

4 HPCE技术中药指纹图谱研究展望

HPCE技术在中药成分分析中的应用虽然起步较晚，但在中药分析领域中充分展示了其优越性，有广阔的应用前景。它作为一种新的分离手段已应用到分析的各个方面，且分离效率高、用量少、速度快、操作简便、费用低，在中药及其复方制剂的分析、鉴定及指纹图谱建立上提供了一种高效、准确的方法。但是CE重现性较差、线性范围窄、灵敏度低，尚无专属的监测器，若将HPCE技术联用其他技术，如CE-MS、CENMR以及CE-MS-MS、HPLC-HPCE-MS、CE-原子发射光谱（AES）、CE-电感耦合等离子体（ICP）-MS[2]以及不同电泳技术之间的联用[23]，会拓宽其应用范围，弥补其不足，达到快速完成众多复杂成分的分离和结构鉴定的目的，这在中药及其复方制剂化学成分的分析中尤为重要。随着仪器的不断改进，HPCE技术作为一种强有力的分析技术，在中药质量控制方面将大有作为，将会在中药领域中发挥越来越重要的作用，在推动中药走向世界的进程中作出巨大贡献。

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