鹦鹉热嗜衣原体分子生物学检测方法的研究进展

任 健，柳陈坚，李海燕

(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明650224)

鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)为鹦鹉热(Psittacosis)即鸟疫(Ornithosis)的病原体；同时，它具有广泛的感染谱，不仅能够感染130多种鸟类、数十种哺乳动物，也可以感染人引起相应的各种疾病。各种动物或人由于接触感染C.psittaci的家畜或禽鸟类的分泌物、排泄物而引起感染，该病是典型的动物源性传染病。鸟类大多呈现隐性持续感染，并且主要为个体散发，但也有群体流行爆发的病例。其临床主要表现为结膜炎、鼻炎及腹泻。人感染发病时，主要表现为寒颤、发热、咳嗽和胸闷等非典型性肺炎的症状，此时的呼吸道分泌物具有传染性[1]。该病在20世纪30年代初有过一次大流行，由此受到广泛关注，同时作为一种人畜共患传染病，快速准确的诊断和检测手段对于控制该病的流行显得尤为重要。目前我国对嗜衣原体的检测主要停留在细胞培养及免疫检验阶段，与分子生物学检测方法相比，传统检测方法均表现出特异性与敏感性低，耗时长，诊断方法繁琐，确诊率低等缺陷。

1 传统C.psittaci检测方法

1.1 细胞培养法 常见有两种方法，一种是利用HeLa 229细胞或McCoy细胞进行分离培养，另一种则是通过鸡胚卵黄囊接种培养，随后均经过姬姆萨染色或荧光染色，最终利用显微镜鉴定包涵体。细胞培养法由于其敏感性、特异性、阳性与阴性预期值等均相对可靠，并且重复性好等，而一直被认为是检测该病原体的“金标准”方法。然而，细胞培养法对样品的预处理要求高，培养时间长，检出率存在局限性，因此不适用于大规模的流行病学调查。

1.2 免疫检测方法 主要包括抗体和抗原检测。实验室常用免疫荧光法(IFA)和补体结合试验(CFT)进行抗体检测，前者主要通过检测经荧光标记的抗原与机体产生的相应IgG抗体是否特异性结合，从而对机体是否感染C.psittaci做出初步判断；而后者以免疫溶血机制作指示系统，利用已知的C.psittaci抗原来检测机体内相应的抗体。由于年龄及感染时间等因素影响抗体的产生滴度，这两种方法的检测敏感性与特异性的再现性差；同时，这两种方法还存在耗时长、操作要求高等缺陷，最终影响该疾病的诊断。此外，以C.psittaci的脂多糖(LPS)、热休克蛋白(HSP)或主要外膜蛋白(MOMP)作为靶点，应用直接涂抹染色法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光和免疫层析等抗原检测方法也经常应用于嗜衣原体及衣原体的检测。目前在畜牧业中，ELISA较为广泛地被应用于嗜衣原体及衣原体所引起疾病的检测与临床诊断中。例如针对猪衣原体而建立的Dot-ELISA检测方法，通过与间接补体结合试验(ICF)进行了比较，结果显示出该方法不仅比ICF敏感性要高，而且特异性也较强[2]。抗原检测虽然在敏感性方面优于抗体检测，但是抗原蛋白特异性识别位点易发生交叉反应而出现假阳性，最终导致该疾病的误诊。

总之，传统检测方法虽然相当成熟，但是在结果判定上受主观经验的影响，同时又由于有些检测方法易出现交叉反应而导致检测特异性的降低，最终影响该病的临床确诊。随着分子生物学在传染病临床诊断及微生物鉴定领域的广泛应用，国内外学者开始探讨利用分子生物学方法检测嗜衣原体及衣原体。研究表明，分子生物学检测体系整体展现出特异性强、敏感性高等优点，从而在病原微生物的临床检测方面得到广泛应用。

2 分子生物学检测体系

分子生物学检测体系是以基因检测为基础，通过对病原体特定基因的分析从而对该病原体进行定性乃至定量分析的一种检测体系。核酸杂交是最早应用于衣原体诊断的分子生物学方法，其基本原理是利用标记过的特异性探针与待测核酸按照碱基互补原则进行杂交，通过对探针的检测从而对相应病原微生物进行鉴定。由于该方法特异性低及敏感性弱而未得到应用。而基于PCR原理的基因检测技术由于特异性好、敏感性高，则逐渐成为衣原体分子生物学诊断的主流方法[3]。国外最早将PCR技术应用于衣原体诊断，并相继建立了以热休克蛋白、脂多糖基因为靶基因的PCR检测体系[4]。16S rRNA基因分析早已被应用于细菌的分类鉴定，上世纪80年代，Weisburg等对嗜衣原体与衣原体的16S rRNA基因进行分析，确立了以16S rRNA为基础的嗜衣原体与衣原体的鉴定体系[5]。然而由于它们的16S rRNA同源性较高，不能对种属进行明确地鉴定，从而无法针对该疾病进行准确有效的临床诊治。随着对嗜衣原体及衣原体的深入研究，研究者们先后发现MOMP基因呈现出更强的特异性，在种属鉴定上更具有应用价值[6-7]。主要外膜蛋白是呈感染性的原体(EB)表面的主要膜蛋白，作为一种保护性抗原可刺激机体产生中和抗体。MOMP有4个可变区(VDs)，分别镶嵌于5个高度保守的恒定区内，其中血清型特异抗原决定簇位于VD1与VD2区，而种特异抗原决定簇位于VD4区，从而奠定了MOMP蛋白基因在衣原体与嗜衣原体分子生物学鉴定上的基础。

3 分子生物学检验体系的发展

3.1 普通PCR检测 1989年，Polland等以16S rRNA为靶基因，利用PCR方法检测到MyCoy细胞培养物中的C.psittaci和沙眼衣原体(C.trachomatis)[8]。随后，出现了以MOMP基因为靶基因的衣原体PCR检测体系，该体系比Polland等构建的检测体系特异性高，能够特异性鉴定出标本中C.psittaci、沙眼衣原体和肺炎嗜衣原体(C.pneumoniae)[9]。研究发现，PCR检测方法的敏感性高于细胞培养法和ELISA法，然而其他两种方法的检测特异性明显高于PCR法[10]。这是因为普通PCR引物单一，无法满足在嗜衣原体及衣原体种属鉴定上所需的特异性。而且该方法在琼脂糖凝胶电泳过程中还存在PCR扩增产物分离的效果差，主观性和经验性及实验后交叉污染等缺点，均会导致假阳性或假阴性结果的出现，从而影响临床诊断，最终导致误诊或漏诊[11]。

3.2 多重PCR检测 多重PCR检测是在PCR反应基础上克服了普通PCR引物单一所引起的检测特异性低的缺陷改善发展而来。例如，国外以16S rRNA为靶基因，建立起了衣原体属及C.psittaci、沙眼衣原体和肺炎衣原体种特异性多重PCR检测体系，研究结果表明，该检测体系对C.psittaci的阳性检测率比细胞培养方法至少高一倍[12]。为进一步提高特异性，郝永新等根据C.psittaci的rrn操纵元基因即16S-23S rRNA间隔区基因和23S rRNA基因分别设计合成2对引物用以检测C.psittaci。该方法的特异性和敏感性均高于普通PCR法及免疫荧光检测法[13]。套式PCR(nPCR)是利用内外两套引物而构建的一种特殊的多重PCR检测体系。糜祖煌等利用该原理构建的16S rRNA基因nPCR检测体系不仅能够特异性检测出C.psittaci菌株，而且能够排除沙眼衣原体、肺炎嗜衣原体、肺炎支原体等其它微生物的干扰。该检测体系的灵敏度较普通PCR高100倍左右，特异性亦明显高于普通PCR检测方法，同时避免假阳性的出现，为C.psittaci的临床诊断提供了准确的检测体系[14]。

随着对C.psittaci的深入研究，根据表型特性、致病性和遗传性的不同，C.psittaci被分为A、B、C、D、E、F、WC、M56及E/B等9种血清型，研究表明9种血清型与基因型均保持一致。各血清型的宿主、生理活性及致病性均存在一定差异，由此多重PCR在C.psittaci的分型及分子流行病学研究上出现瓶颈。随后，改进的RFLP-PCR分析技术在对C.psittaci进行特异性检测上逐渐显现出其优势。

3.3 RFLP-PCR分析 RFLP-PCR分析即是对特异性PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析的方法。例如根据衣原体MOMP基因的恒定区和可变区分别设计衣原体科特异性引物和种特异性引物，经过PCR反应对相应的衣原体菌株进行扩增，然后利用RFLP分析该PCR扩增产物。该体系不仅可以达到检测与甄别衣原体的目的，而且还可以利用RFLP分析衣原体的侵袭性[15]。很多数据显示该方法所得结果与血清型具有高度一致性，但也存在一些非一致性的结果[16-18]。最近，Laroucau等以多对基因座变数串联重复序列分析(Multiple loci variable number of tandem repeats analysis， MLVA)[19]的 方 法 为 基础，开发出一种高灵敏度、高分辨率的C.psittaci新检测体系-MLVA系统[20]，为鹦鹉热分子流行病学研究提供了一种新手段。该体系与血清学和ompA基因序列测定相比表现出更高的分辨率，在C.psittaci检测及基因分型上具有优势。然而，该检测体系由于不能对C.psittaci进行定量检测，因此有必要开发既具有高度特异性又能够对该病原体进行定量检测的分子生物学检测体系。由于固相捕获技术的成熟和应用，特别是ELISA为核酸定量提供了一个良好的实验方法。随后，应用ELISA原理进行固相捕获的PCR-ELISA定量技术应运而生。

3.4 PCR-ELISA PCR-ELISA是在PCR扩增以后，在微量板上借用ELISA的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现衣原体的定量检测。使用PCR-ELISA试剂盒能够快速地检测出病料组织中的目的基因片段，研究结果显示，该方法比免疫荧光抗体法特异性要高很多，却略逊于普通PCR法[21]。由于普通PCR法缺点是需进行凝胶电泳而容易出现交叉污染,从而导致假阳性结果的出现，而PCR-ELISA法最大的优势在于可以很好地对检测样本进行定量，其强阳性、弱阳性结果均容易甄别，从而适合在进行C.psittaci的流行病学调查时应用。虽然目前欧洲些国家已经将PCR-ELISA试剂盒作为参考诊断试剂用于常规检测，但是由于PCR-ELISA法在扩增之后又要进行ELISA反应，而ELISA是一个开放性的反应，很容易产生污染引起假阳性，最终导致误诊。而封闭式自动化定量基因检测技术的快速发展为实时定量检测衣原体提供了必要的条件。1996年由美国Applied Biosystems公司推出的实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)，不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化程度更高、有效解决后PCR污染问题等特点，不失为一种首选检测方法。

3.5 Real-time PCR Real-time PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。目前运用SYBR Green标记与TaqMan探针最为常用于Real-time PCR检测。2005年，国外率先建立了以ompA为靶基因的Real-time PCR检测体系，并对C.psittaci的血清型A-F及E/B进行了种属鉴定。该C.psittaci检测体系不仅具有很高特异性，而且能达到10拷贝/μL的敏感性，这表明Real-time PCR在嗜衣原体与衣原体临床检测和诊断上将具有重要的应用价值[22]。而在国内，成本相较低廉的SYBR Green Real-time PCR检测体系一直广受青睐。我国学者成功构建了以23S rRNA基因为靶基因SYBR Green的LightcyclerTM检测体系，并将C.psittaci、沙眼衣原体、肺炎嗜衣原体和反刍动物衣原体4种常见嗜衣原体及衣原体进行特异性甄别并加以定量。在临床检测中，与传统的免疫荧光组化分析相比，Real-time PCR表现出较高的特异性，并且其检测敏感性能达到10-1IFU相当的水平，使得Real-time PCR有望成为C.psittaci临床检测的一个快速、可靠的方法[23]。为提高临床上C.psittaci鉴别诊断特异性，王争强等以MOMP基因为检测靶基因，建立具有更高特异性的SYBR Green Real-time PCR检测体系。该体系在对C.psittaci与其他嗜衣原体、衣原体及病原体进行鉴别诊断时表现出高特异性的同时，检测敏感性超出常规PCR的100倍，其检测限度为50拷贝/反应[24]。由此表明，Real-time PCR在提供高特异性，高敏感性检测的同时，还能对检测样品进行定量分析，为鹦鹉热的临床诊治及流行病学研究提供了有效的科学依据。

4 总结及展望

目前国内的C.psittaci分子生物学检测技术刚刚起步，准确、灵敏的新型分子生物学检测技术正日益显现出优势。由于SYBR Green Real-time PCR方法成本低，国内研究者大多构建以SYBR Green为主的C.psittaci检测体系，虽然其在C.psittaci诊断时与普通PCR相比，检测特异性与敏感性都高，然而与TaqMan探针Real-time PCR相比，其特异性就稍显逊色，因此进一步开发特异性与敏感性俱佳的C.psittaci的分子生物学检测体系就势在必行。我们可以通过提高目的基因位点的特异性或者利用与MGB探针结合增加分析单碱基突变的能力而达到更精确鉴别的目的。同时，将多重PCR与Real-time PCR相结合，建立多重Real-time PCR检测体系也不失为C.psittaci特异性检测体系研究的最佳途径。

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