Dex疫苗的研究现状及其在自身免疫性疾病的应用①

尹炜凡 综述 杨 欢 审校 (中南大学湘雅医院神经内科,长沙 410011)

外泌体是由活细胞分泌的直径为60～90 nm的囊状小体,在电镜下为脂质双层膜包围的扁平球体,呈特征性的杯状外型,存在于血清、尿液、唾液、乳汁等体液中[1]。作为一种亚细胞结构,它能代表其来源细胞行使一系列生物学功能,如肿瘤细胞来源的外泌体能介导免疫逃逸,肠上皮细胞来源的外泌体参与了口服耐受作用的发挥,胎盘绒毛膜上皮细胞来源的外泌体能介导母胎耐受等等。近年来,树突状细胞(DC)来源的外泌体(Dex)引起了人们广泛的关注,因其即能诱导机体抗肿瘤,抗弓形虫等病原体的强烈的适应性免疫应答,又能在一定条件下诱导抗原特异性的免疫耐受,在介导抗肿瘤免疫、移植免疫耐受方面显示了巨大的应用前景。近年来其在自身免疫性疾病治疗中的应用也逐渐引起关注,本文就Dex疫苗的研究现状以及Dex在自身免疫性疾病的临床应用作一简要综述。

1 Dex疫苗的研究现状

1.1 Dex疫苗的体内作用机制 应用荧光示踪,可以发现Dex在体内的迁移途径。将髓源Dex真皮内或皮下注射入小鼠体内,在注射部位Dex即能被位于皮肤的未成熟DC捕获,其表面表达的分子被未成熟DC吸收,24小时后DC和Dex复合物则迁移至相应的引流淋巴结区,引起相应的免疫应答或者诱导抗原特异性的免疫耐受[2]。

目前Dex在体内具体的作用机制尚不清楚,研究发现,Dex疫苗在体内产生的免疫效应与Dex表面分子和机体的内环境有关。成熟树突状细胞来源外泌体(mature dendritic cell derived exosome,mDex)表面高表达MHC Ⅱ 、CD40、CD80、CD86共刺激分子,在相应的淋巴结引流区,mDex能与DC和T细胞相互作用,使初始T细胞活化为抗原特异性T细胞,诱导强烈的适应性免疫应答。而非成熟树突状细胞来源的外泌体(immature dendritic cell derived exosome,imDex)表面低表达 MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86 共刺激分子,在与引流区淋巴结T细胞相互作用时不能活化T细胞,导致T细胞无能或低能反应,从而诱导免疫耐受。在小鼠心脏移植的实验中发现,预先用imDex处理受者,移植手术后受者体内CD4+细胞显著减少,且移植物中浸润的白细胞减少,IFN-gama mRNA的表达明显下降[3]。应用基因工程技术使树突状细胞表面表达FasL、IL-4、IL-10等分子来源的外泌体(即 Dex-FasL、Dex-IL-4、Dex-IL-10)能启动 T 细胞内的免疫抑制信号,诱导T细胞凋亡,产生免疫耐受效应。研究发现,Dex-IL-4、Dex-IL-10和 Dex-FasL表面表达较高浓度的FasL,它们利用Fas/FasL途径诱导T细胞凋亡,产生免疫耐受效应[2,4,5]。机体的内环境主要指的是DC的成熟状态,研究发现DC的成熟状态对于Dex疫苗效应的发挥起重要作用。在无DC或未成熟DC存在的条件下,mDex或imDex均不能有效激活T细胞,而应用促DC成熟因子(LPS、TNF-α、CpG、CD40L)后,mDex或 imDex在体内能不同程度的激活T细胞[6]。

1.2 Dex疫苗的应用途径 研究证明,通过真皮内注射的Dex能刺激引流淋巴结区3.8%的淋巴细胞增殖,而皮下注射的Dex仅能引起 0.9%的淋巴细胞增殖,表明通过真皮内注射的 Dex能够影响的淋巴细胞数是皮下注射的4倍[7]。因此,我们不难推断,要想在免疫增强或者免疫耐受中取得较大效果,应该采用真皮内注射,而非皮下注射的方式。然而,上述两种途径与静脉注射的途径相比,哪种更能影响淋巴细胞尚无报道,有待进一步研究。

1.3 Dex疫苗的特点 mDex疫苗已经应用于治疗黑色素瘤和非小细胞肺癌的1期临床试验,显示了巨大的应用前景。与传统的DC疫苗相比,Dex疫苗安全稳定具有以下优点:①非细胞性,可以冷冻储藏,在冰冻状态下储存几个月,活性不会受影响。②Dex疫苗注入体内后其表面分子不会像DC那样经历表型变化,而且其在体内发挥作用不受CTL细胞的影响[8]。③Dex疫苗的副作用轻微且可耐受。在进展性非小细胞肺癌的临床试验中,9名Ⅲ～Ⅳ期非小细胞肺癌患者在实验前接受了Dex介导的迟发型超敏反应的观察。研究发现,3名患者48小时后的皮肤测验结果显示阳性。其中,2名患者有5 mm的硬结和红斑,1名患者有6 mm的硬结和红斑。整个实验结束后的副反应观察发现8名患者有注射部位的红斑、硬结和肿胀。1名患者有流感样症状,1名患者有手臂的外周性水肿[9]。④Dex疫苗具有抗原特异性。利用exosome display技术将可溶性抗原负载至Dex上,可以产生抗原特异性 Dex[10]。该种Dex用于小鼠体内能产生特异性的免疫应答或免疫抑制效应。

1.4 Dex疫苗在抗肿瘤治疗的应用 鉴于负载肿瘤抗原肽的Dex在体内能引发CD4+或CD8+T细胞介导的抗原特异性的免疫应答以及能够按照GMP标准成功地制备人单核细胞源DC来源的Dex。目前Dex在抗肿瘤方面应用的研究广泛开展。在恶性程度极高的黑色素瘤的治疗中,给15例表达MAGE2的黑色素瘤患者每周四次的皮下或者静脉注射冰冻保存的负载MAGE2抗原肽的Dex,连续使用四周,剂量逐步增加,对于病情稳定者和肿瘤消退者再每3周注射一次,结果发现间接负载处理的Dex使1例患者病情得到稳定,并接受了后续的每3周注射1次,共8次的治疗,患者病情得到了长期控制。间接负载处理的Dex使1例患者皮下肿瘤消退,但是发生了肺转移[11]。在Ⅲ、Ⅳ期非小细胞肺癌即进展性非小细胞肺癌的临床试验中,入组的病人有9例,在为期两年的随访观察中2例病人的病情稳定时间超过了12个月[9]。上述研究使我们看到了Dex在临床抗肿瘤治疗中的巨大应用前景,然而要想让Dex疫苗发挥更好的抗肿瘤效果,Dex的结构、体内应用的方式方法以及最适剂量方面有待进一步研究。

1.5 Dex在移植免疫耐受方面的应用 髓源imDex和调节树突状细胞来源外泌体(regulatory dendritic cell derived exosomes,rDex)均能够诱导宿主的移植免疫耐受。Pêche等[12,13]先后证实了在小鼠心脏移植手术中,髓源imDex能调节受者的抗移植免疫反应,并能显著延长同种异体心脏的存活时间。刘袁媛等[14]在小鼠皮肤移植试验中观察到 rDex比 imDex能产生更好的移植免疫耐受效应。上述动物实验预示着Dex将会是抗移植排斥反应的新方法。

2 Dex在自身免疫性疾病治疗中的应用

目前,Dex在自身免疫性疾病治疗方面的应用主要是在对风湿性关节炎治疗的观察上。风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。实验观察所应用的研究模型为迟发型超敏反应模型。研究发现,imDex以及通过基因工程技术使髓源DC表面表达IL-4、IL-10、FasL来源的Dex均能产生抑制迟发型超敏反应的作用。尽管其具体作用机制尚不十分明确,但是上述实验研究能够为将抑制性Dex用于其它自身免疫性疾病治疗的研究奠定了基础。

过表达吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4融合蛋白(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4 immunoglobulin,CTLA-4Ig)的髓源DC来源的外泌体(IDO/Dex和CTLA-4Ig/Dex),能够抑制小鼠迟发型超敏反应的炎症进展,阻止类风湿性关节炎的病情进展。IDO是近来研究较多的一种免疫调节蛋白,能够维持外周耐受,在妊娠、肿瘤、自身免疫性疾病和移植耐受方面起着重要作用。IDO能降低T细胞中色氨酸的含量,利用产生细胞毒性代谢产物,即犬尿氨酸,影响T细胞的活性。CTLA-4Ig是 IDO的诱导物,通过DC表面B7分子能诱导DC表达IDO。研究发现,IDO/Dex本身并不含有 IDO蛋白,它们能产生免疫耐受的可能机制是传递功能性的IDO蛋白给DC或者T细胞[15]。

2.1 体外预实验 首先,通过基因工程技术使表面表达细胞因子IL-10的髓源DC分泌外泌体,即重组IL-10(r-IL-10)处理过的或含IL-10重组腺病毒载体感染(v-IL-10)的骨髓来源的Dex(r-IL-10/Dex和v-IL-10/Dex),在将其应用于于小鼠体内试验之前先检验了其是否具备抑制T细胞活性的功能。将vIL-10/Dex、未转染 IL-10的普通髓源 Dex和 rIL-10/Dex分别加入混合淋巴细胞液中,5天后观察其中的T细胞增殖情况。结果发现,vIL-10/DC能完全抑制T细胞增殖,未转染IL-10的普通髓源DC的抑制作用很少或者基本没有,而rIL-10/Dex具有中等的抑制效果[4]。该实验不仅证实了IL-10/Dex的免疫抑制效应,而且比较了三种Dex的免疫抑制效应,显示了通过病毒转染的IL-10/Dex的免疫抑制效应更强,为IL-10/Dex及其他抑制性Dex的体内应用奠定了基础。

2.2 体内试验的应用 在小鼠迟发型超敏反应模型中,分别比较vIL-10/Dex、vIL-10/DC和生理盐水抑制迟发型超敏反应的能力。分别将vIL-10/Dex、vIL-10/DC和生理盐水注入小鼠一侧的后足垫真皮内,对侧注入等剂量的生理盐水,分别在24、48和72小时后观察双侧足的肿胀情况,并用宏观评分系统进行记录。结果显示和生理盐水组相比vIL-10/DC组注射足的足垫肿胀情况减轻了大于50%,对侧肿胀情况减轻了40%。vIL-10/Dex组双侧足垫肿胀情况减轻了65%。在胶原性关节炎的模型中,在小鼠被抗原免疫后的第28天,静脉注射vIL-10/Dex和等剂量的生理盐水对照,结果注射vIL-10/Dex组不仅胶原性关节炎的发生日期推迟了,疾病的严重程度亦降低了。而生理盐水组的胶原性关节炎则按往常一样进展。同样的,将通过基因工程技术使表面表达IL-4或FasL的髓源DC来源的Dex,即IL-4/Dex或FasL/Dex,真皮内注入小鼠一侧后足垫,亦能减轻小鼠足关节的迟发型超敏反应,当静脉注射上述Dex时能够推迟胶原性关节炎的发生时间以及减弱其炎症反应的程度。尽管Dex诱导免疫耐受的具体作用机制尚不明确,但是Kim[2]对 Dex进行荧光标记示踪发现,在注入真皮内的48小时后,在真皮中能检测到Dex和CD11c+细胞的复合物,在同侧窝的淋巴结引流区该复合物亦被检测到,而在对侧淋巴结引流区、肝脏和脾脏中则未被发现。这似乎不能解释对侧关节的免疫抑制现象。对于静脉注射的Dex而言,24小时后检测到Dex在肝脏中被F4/80-(大部分为CD11c+)细胞所捕获,在脾脏中则被F4/80+脾巨噬细胞所捕获。将用IL-4/Dex致耐受的小鼠迟发型超敏反应模型中的CD11c+分离出来,在将其注入同基因系的被抗原致敏的小鼠体内,亦能减轻迟发型超敏反应的炎症程度。这不禁使我们联想到,Dex在真皮内注入后,和同侧淋巴结区的CD11c+细胞作用将自身所携带的致免疫耐受分子传递给CD11c+,由CD11C+行使抑制抗原特异性免疫耐受的作用。而静脉注射的Dex则循环至肝脾区,被F4/80+脾巨噬细胞和肝脏 F4/80-细胞捕获,传递免疫抑制性分子后,由F4/80+脾巨噬细胞和肝脏F4/80-细胞行使免疫抑制功能。进一步的致免疫耐受机制尚不清楚,有待于进一步研究。

2.3 Dex免疫抑制效应发挥的几个关键问题 要想发挥Dex的免疫抑制功能,并将其成功地应用于自身免疫性疾病的动物模型和临床试验,有几个关键的问题不容忽视。

2.3.1 外泌体的完整性 外泌体膜是否完整对于其免疫抑制效应的发挥起着至关重要的作用。Kim等[2]发现在小鼠的迟发型超敏反应模型中,经过四轮的冰冻-解冻处理后的髓源Dex/vIL-10或Dex/rIL-10不再具备抑制关节炎炎症反应的作用,电镜观察到经过四轮的冰冻-解冻后,Dex表面双层膜不再完整,并且在Dex碎片中Hsc70已经检测不到了,而已知的Hsc70是体内诱导T细胞耐受的重要分子。同样的,通过声裂解处理的Dex表面膜裂解,亦不能发挥其免疫抑制效应。

2.3.2 免疫抑制效应的发挥所依耐的分子 Dex免疫抑制效应的发挥与其表面分子相关。首先,供者Dex必须和受者来源于同一基因型,Dex免疫效应的发挥具有MHC依赖性。其次,给Dex负载一定抗原肽产生的免疫耐受效应是针对特定抗原,对其它抗原则不起作用。另外,根据前述,IL-4/Dex、IL-10/Dex和FasL/Dex能够产生对类风湿性关节炎的炎症抑制作用与其表面表达FasL有关。在IDO试验中,IDO/Dex和CTLA-4Ig/Dex作为媒介传递功能性的IDO蛋白,其抑制效应的发挥必须有B7分子的参与。

3 问题与展望

Dex在动物实验和临床试验的应用研究提示,Dex在抗肿瘤免疫和诱导移植耐受有巨大应用前景。然而,对于Dex的具体体内作用机制,以及作为亚细胞结构的生物性疫苗,如何使其功能发挥最大的作用以及如何最大限度降低其副作用仍需要进一步研究。

近年来,Dex在治疗自身免疫性疾病的研究陆续开展,在风湿性关节炎模型中,我们看到了IL-4/Dex、IL-10/Dex、FasL/Dex、IDO/Dex 和 CTLA-4Ig/Dex对风湿性关节炎炎症反应的抑制作用,这为我们将抑制性Dex应用于自身免疫性疾病奠定了基础。然而各种Dex的具体作用机制尚未完全明了,需要进一步研究。为将Dex应用于临床,我们必须找到一种免疫抑制效应最强的Dex,故我们尚须比较等剂量的上述四种Dex和imDex或者其它抑制性Dex免疫抑制效应的程度、起效时间和作用持续时间等方面有无差异。另外,Dex的免疫效应的发挥与其剂量是否有关、是呈何种关系以及如何调控其剂量以取得最大的免疫抑制效亦尚须进一步研究。

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