两种 HSV-1及猴B病毒相关抗体测定方法的比较

(中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021)

乔红伟,佟 巍,蒋 虹,丛 喆,王 卫,魏 强

技术方法

两种 HSV-1及猴B病毒相关抗体测定方法的比较

(中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021)

乔红伟,佟 巍,蒋 虹,丛 喆,王 卫,魏 强

目的以人单纯疱疹病毒(HSV-1)做为抗原,利用空斑法和 IFA法比较猴BV和人 HSV-1阳性血清两种不同血清的中和能力的差异,建立一种实用、准确、可靠的病毒毒力的检测方法。方法首先,将 HSV-1病毒悬液作连续的10倍稀释,取1 mL接种于已经长成单层的Vero-E6细胞上,用1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数,算出病毒悬液中每毫升所含蚀斑单位,即滴定出 HSV-1的 TC ID50。同时,用免疫荧光方法 (IFA)对猴和人疱疹阳性血清进行滴定,得到其血清的效价。其次,用滴定出的病毒液分别与两种阳性血清体外中和后,接种到单层的Vero-E6细胞上,用 1%甲基纤维素覆盖,待其出现蚀斑后计数。最后,计算出其蚀斑减少率。结果用 1%甲基纤维素作覆盖层的蚀斑数量平均为 10-5PFU,能形成 115～116个/mL蚀斑,形状呈黍米大小的规则圆形,其蚀斑边缘清晰。IFA滴定的人 HSV-1阳性血清与猴BV阳性血清的中和抗体均为 1∶80。人 HSV-1和猴BV两种阳性血清的空斑减少率均为 100%。结论确定了利用 1%甲基纤维素做为覆盖层可得到清晰可靠的蚀斑,由此方法检测到用人HSV-1可以代替猴B病毒,筛查猴B病毒抗体。且为将来进行药物筛选和中和实验中利用病毒空斑法建立方便、可靠的方法。

猕猴疱疹病毒 1型;人单纯疱疹病毒Ⅰ型;空斑减少;免疫荧光

猴疱疹病毒 (Simian Herpes Bvirus)也称 B病毒,属疱疹病毒科。1934年,Sabin等首次从被咬伤致死的人脑和脾中分离得到,猕猴为自然宿主。人类感染B病毒主要表现为致死性脑脊髓炎,并发生死亡。目前,我国国标要求用 B病毒检测猴血清,但生物安全要求高等级实验室中进行,以往主要使用与B病毒密切相关的单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)作抗原,检测猴群中 B病毒感染的情况,起到积极意义。文献报道我国猴群中 BV抗体阳性率高达10%～60%[1]。1997年我国分离得到了 1株 B病毒,命名为BV147[2],但由于BV操作要在生物安全4级实验室(ABSL-4)进行,目前我国还没有建立此实验室,因此寻找一种安全的替代方法非常必要。

我国研究人员已经成功建立了免疫荧光法(F IA)和免疫酶法 (E IA)对 BV阳性抗体进行了检测[3]。蚀斑技术可以准确测定病毒悬液中感染病毒的含量,由于特异性抗体能够抑制病毒产生蚀斑,可以用蚀斑技术测定动物血清和其它体液内的中和抗体,即产生蚀斑抑制现象。细胞病变实验参照常规方法,本实验在原有的蚀斑实验的基础上进行了改进,即用人 HSV-1抗体阳性血清和猴BV抗体阳性血清体与人 HSV-1体外中和后,改用 1%甲基纤维素作为覆盖层,检测其对敏感细胞产生的蚀斑减少数目,能形成肉眼可见的清晰的蚀斑,从而确定这种方法的可靠性。

1 材料和方法

1.1 细胞和病毒存储液

VeroE6非洲绿猴肾细胞 (本室保存,引自美国ATCC)用于 HSV-1的培养和中和试验。HSV-1抗原片由本室制备,人 HSV-1毒株、猴 B病毒感染阳性血清由本室保存,人单纯疱疹病毒阳性血清由某医院健康体检人群筛查获得。HSV-1病毒存储液的制备:用DMEM高糖细胞培养液(含有100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素、2 mmol/L L-谷胺酸和10%胎牛血清)在细胞瓶中培养 VeroE6细胞,长成单层后接种 HSV-1病毒,病毒在 VeroE6细胞上繁殖到 0.01 MO I(感染复数)时,反复冻融,离心收集上清液,用 0.22μm的滤器过滤,于 -80℃保存备用。将病毒存储液 1∶10梯度稀释,在长成单层VeroE6细胞的 96孔细胞培养板上滴定,2×105细胞/孔时,在接种第 4天时,观察细胞病变 (用MTT法)计算出其 TC ID50,计算出 HSV-1的 TC ID50是10-5。2%甲基纤维素 (4000cP;Sigma,MC)配制,称取 8.8 gMC用 320 mL的三蒸水溶解,用磁力搅拌器进行搅拌。溶解后,在 121℃高压 30 min,用前与等体积的 2×DMEM混匀即可。PBS(pH7.2),4%多聚甲醛,0.5%结晶紫。12孔组织培养板,96孔 U型组织培养板 (Corning,NY),单道和多道微量加样器,Tip头。所有涉及到活病毒及感染细胞的培养到要在生物安全柜内进行。洁净工作台,5%CO2的 37℃细胞培养箱,37℃恒温培养箱,-70℃冰箱,倒置显微镜。

1.2 HSV-1和 BV阳性血清免疫荧光法检测

用含10%牛血清 PBS封片,即用10%牛血清滴加所有抗原孔,包括正常抗原孔和病毒抗原孔,滴加好的玻片马上放入湿盒内,于 37℃孵育 0.5 h。取出玻片,用 PBS洗 3次,每次浸泡 5 min。玻片自然干燥,待检血清 56℃孵育 0.5 h灭活后,1∶10稀释,滴加至检测抗原孔内,同时做阳性血清和阴性血清对照,滴加时应避免交叉串孔,滴加好的玻片应马上放入湿盒内,于 37℃孵育 0.5 h。取出玻片,用 PBS洗3次,每次浸泡5 min,期间轻轻震摇数次。待玻片干燥,各检测孔滴加荧光结合物 (用前稀释),放入湿盒内 37℃孵育 0.5 h。玻片用蒸馏水漂洗 2次,在用 50%甘油封片后,即可在荧光显微镜下观察结果。

1.3 空斑实验及空斑减少实验

在 12孔组织培养板中用空斑实验检测 HSV病毒的噬斑形成单位 (pfu)。将 VeroE6细胞 (平均每孔 0.5×106个细胞)接种到 12孔组织培养板上。在 37℃5%CO2培养,培养 24 h后用于接种。在 96孔U型板中,用 100μL的 SCV的 50 pfu(相当于 16 000TC ID50),与不稀释或者进行系列稀释的血清进行中和,37℃孵育 1 h。弃去 12孔培养板中培养液,取上述孵育好的混合液 100μL加入到培养好的 12孔板的VeroE6细胞中在 37℃孵育 1 h。用无血清DMEM洗板。用 1 mL的 1%甲基纤维素覆盖单层细胞,在 37℃孵育 2 d。弃去上清,用 PBS洗板。加入 250μL/孔预冷的 4%多聚甲醛在室温下作用30 min。弃去 4%多聚甲醛溶液,用 PBS洗板 2次。单层细胞用 300μL的 0.5%结晶紫在室温下染色5 min。用蒸馏水洗板 2次。培养板在空气中干燥后,进行空斑计数。

2 结果(图 1～4见彩插 9)

2.1 HSV-1免疫荧光检测结果

利用间接免疫荧光 (IFA)方法,用 HSV-1制备的细胞抗原片,对人 HSV-1和猴BV阳性血清进行抗体检测。阳性血清 10、20、40、80、160倍稀释的工作浓度下,在血清浓度稀释到 80倍时仍可以观察到免疫荧光,且人和猴血清的荧光强度和数量基本相同(图 1)。

2.2 HSV-1空斑实验结果

利用空斑减少 (PRNT)方法,对 HSV-1进行滴定,确定其最佳空斑计数浓度为 10-5,其空斑的数量平均为 115个/mL。用确定的病毒液浓度分别与在 1∶10稀释的基础上进行 2倍梯度稀释的人和猴的阳性血清体外中和后,作用于培养好的单层VeroE6细胞,同时做细胞和病毒对照。最后进行空斑计数,计算空斑减少率均为 100%(图 2,图 3)。空斑结构清晰可见(图 4)。

以 HSV-1为抗原,分别用 IFA和 PR检测后结果进行比较,IFA的方法只能检测到血清稀释为1∶80,而 PRNT的结果可以检测到 1∶105。

3 讨论

中国恒河猴做为主要的非人灵长类实验动物,不仅在我国的新药和各种疫苗的研制中具有重要的作用,而且在世界各国科研,特别是 H IV/A IDS的研究中有着不可替代的作用[3,4]。由于 BV感染是人兽共患病,除了干扰实验研究,还能引起实验人员的感染和死亡,因而对其病原的检测越来越受到重视。自 1989年吴小闲等[5]成功研制 HSV-1 F IA和 E IA方法以来,国内主要采用该方法检测实验用恒河猴血清中BV相关抗体,此方法为实验用BV阴性猴的筛选和养殖厂猴群体净化的工作起到了很大的促进作用[6]。

根据文献,本实验成功改进了疱疹病毒感染Vero-E6细胞后传统的空斑减少实验的方法,利用甲级纤维素作为固相支持物。我们发现甲基纤维素的分子量对空斑的形成非常重要。当加入含有1%甲基纤维素 4000CP的维持培养基做为覆盖层时,能产生肉眼可见的蚀斑。但是,当使用其它高分子量或低分子量的甲基纤维素混合物时,就不能得到预期的结果。此方法能应用到产生空斑比较难的病毒空斑减少实验中,也可以不用更复杂的分子或生物化学方法去定量分析疱疹病毒滴度的监测。一个重要的因素就是在这个实验中可以根据病毒不同的量进行本实验。其次,我们比较了两种方法抗体检测的结果,发现 IFA和 PRNT法检测结果完全吻合,说明二者都能有效监控 BV抗体的变化,但这两种方法各有优劣。采用 IFA法能清楚地看到被 BV感染的细胞数量,此方法的缺陷是检测水平和检出率的高低受操作人员技术影响较大。PRNT方法也有其缺陷,有文献证明[7],应用此方法成功的对痘苗病毒、麻疹病毒和狂犬病病毒进行了病毒感染和体外中和作用的研究。证明空斑减少实验检测的中和抗体滴度要低于中性红法和 CPE实验结果。利用病毒的MO I是 0.032可以进行空斑减少实验,而中性红和CPE实验MO I的量只需要达到 0.02。可以观察到对于抗痘苗病毒的中和抗体的空斑减少实验和生物标记实验不同中和滴度。因此,空斑减少实验对于高滴度和低滴度的抗病毒抗体都有细微的区别。空斑减少实验的优点是肉眼可见,且空斑实验用细胞板可以保存很长时间。

一直以来,我国都是应用与B病毒具有密切的抗原关系的人单纯疱疹病毒 (HSV-1、HSV-2)中的HSV-1为抗原,进行玻片免疫荧光和免疫酶染色发进行检测[5]。1997年田克恭等[8]从我国野生恒河猴口腔溃疡灶中分离到一株 B病毒,并研制了新的BV抗原片。韦毅等[9],饶军华等[10]、盘宝进等[11]已经对目前BV检测试剂盒和方法进行了各种研究和相互之间的比较。目前国内在猴BV抗体初筛检测方面主要还是使用 HSV-1的免疫酶和免疫荧光,同时结合BV抗原 EL ISA试剂盒附件。因此,为了保证检测结果的准确性,尤其是对进出口实验用猴的检验,建议同时使用 HSV-1抗原片和 PRNT空斑减少实验检测猴 BV抗体,以免漏检而带来不必要的经济损失。

[1] 田克恭.实验动物病毒性疾病[M].北京:农业出版社, 1992:373-380.

[2] 田克恭,蔺会云,遇秀玲,等.PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究[J].中国实验动物学报,2001,4(9):213-215.

[3] 卢耀增,吴小闲,涂新明,等.猴免疫缺陷病毒(S IV)猴模型的建立[J].中国实验动物学报,1994,2(2):94-102.

[4] HessellAJ,Hangartner L,Hunter M,et al.Fc receptor but not complement binding is important in antibody protection against H IV[J].Nature,2007,449(7158):101-104.

[5] 吴小闲,蒋虹,曲立荣,等.恒河猴B病毒相关抗体检测方法的比较[J].病毒学杂志,1989,(1):80.

[6] 魏强.我国实验猕猴的研究及质量标准初探[J].中国比较医学杂志,1996,1:10-12.

[7] Wang SX,Sakhatskyy P,W.Chou TH,et al.Assays for the assess ment of neutralizing antibody activities against SevereAcute Respiratory Syndrome(SARS)associated coronavirus(SCV) [J].J ImmunMeth,2005,301(1-2):21-30.

[8] 田克恭,蔺会云,遇秀玲,等.我国猕猴群B病毒分离鉴定和检测方法研究初报 [J].实验动物科学与管理,2000, 17:364.

[9] 韦毅,符明泰,石寨,等.三种不同抗原对猴B病毒刊检测结果的比较研究[J].实验动物科学与管理,2001,18:1-3.

[10] 饶军华,刘晓明,田克恭,等.猕猴 SPF种群的建立及保持过程中B病毒抗体监测研究[J].中国比较医学杂志,2003,13: 294-296.

[11] 盘宝进.用B病毒 EL ISA和人单纯疱疹病毒 I型酶免疫法检测食蟹猴血清中 B病毒相关抗体的研究[J].广西畜牧兽医,2005,21:10-12.

Comparison of TwoM ethod about Antibody aga inst Herpesvirus Sa im iri from RhesusMacaques

Q IAO Hong-wei,TONGWei,J IANG Hong,CONG Zhe,WANGWei,WEIQiang
(Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences and PekingUnionMedical College; ComparativeMedical Center,PekingUnionMedical College;KeyLaboratory of Human Disease ComparativeMedicine,Ministry of Health,Beijing 100021,China)

ObjectiveTo compare the serological detection sensitivity of sera againstHSV-1 andBV from humans and rhesusmonkeyswith PR(plaque reduction)and IFA(immunofluorescence assay)。MethodsThe PR assay described in this studywasmodified from the traditional viralplaque reduction assay by usingwith 1 mL ofDMEM medium containing 1% (weight/volume)ofmethylcellulose(4000 cP;Sigma,MC),and an improved crystal stainingmethod to achieve better plague for mation in HSV-1 infected Vero E6 cells.The neutralizing antibody titer was determined as the highest serumdilution which achieved 50%plaque reduction。ResultsIn this assay,HSV-1 infected Vero E6 cells for med clear plaques with the density of(115～116)dots/mL.The positive serum neutralizing antibodies titers and ratioswere 1∶80 and 100% both of HSV-1 and BV。Conclusions The PR assay described in this studywill be used not only for serological detection but also formedical selection in cellmodel.

Ceropithecine Herpesvirus type 1(BV);Herpes simplex virus type 1(HSV-1);Plaque reduction; I mmunofluoresence assay(IFA)

R373

B

1671-7856(2010)03-0057-04

2009-11-06

中央级公益性科研院所级本科研业务费,项目号:DWS200708;科技部基础专项重点项目,项目号:2002DEA20023;科技部条件基础平台专项重点项目,项目号:2003D IA7J033。

乔红伟,女,副研究员,研究方向:实验动物病毒学。

魏强,教授,博士生导师,研究方向:实验动物病毒学,疾病模型。E-mail:weiqiang0430@sohu.com