βAmyloid蛋白在恒河猴脑组织中的形态学特点

赵 乔，蔡 青，孟 霞，朱立鸣，李胜利，焦守恕，王 钜

（首都医科大学实验动物科学部，首都医科大学电镜室，北京 100069）

目前关于阿尔茨海默症（Alzhe imer’s disease，AD）的发病机制并不十分确定，但普遍认为［1］，过量的β淀粉样蛋白（β-amyloid peptide，Aβ）的产生和聚集（是senile plaque的主要成分），并参与神经纤维缠结（NFT）的形成，是AD重要的病理学特征之一。Aβ是I型跨膜蛋白淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）的酶解产物［2］。Aβ通常以β-淀粉样蛋白42（amyloid-βprotein 42，Aβ42）和β-淀粉样蛋白40（amyloid-βprotein 40，Aβ40）两种形式存在。Aβ的沉积导致老年斑的形成，可能是所有因素导致AD的共同途径。目前AD相关研究在小鼠和大鼠等模型中取得了一定的成功，但是Aβ抗体药物AN1792在APP转基因小鼠上治疗效果显著［3，4］，在应用到临床时却在一些受试者出现了在小鼠没有发生的严重的副作用，后来的研究发现同样的副作用在猴子身上也能发生［5，6］。这就提示，Aβvaccine类的药物在进入临床试验之前必须在非人灵长类动物上进行药效和毒性实验。那么Aβ淀粉样蛋白在什么年龄的猴子脑中出现较多？主要出现在脑的哪些部位？哪种类型的Aβ淀粉样蛋白在猴脑内老年斑的形成中起主要作用？本文试图通过对不同年龄猴子的研究，对这些问题进行一些初步的讨论。

本研究选用年轻组（5～10岁）和老年组（19～24岁）恒河猴（rhesusmonkey）为研究对象，分别选取额叶、海马、颞叶和顶叶进行Aβ40和Aβ42的免疫组化染色。选取23岁恒河猴一只灌注取脑后进行免疫电镜的超微结构观察，初步从组织学和亚细胞水平观察Aβ40和Aβ42的特点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：恒河猴12只，分为年轻组：年龄5～10岁和老年组：19～24岁，由军事医学科学院实验动物中心提供［SCXK-（军）2002-001］。在首都医科大学实验动物部SPF级动物实验设施中完成［设施许可证号：XYSK（京）2009-0020］。经1个月常规饲养无异常表现，心、肝、肾等重要器官血液生化指标检测正常。

1.1.2 主要试剂：抗βAmyloid 1-40（ab10147）和抗βAmyloid 1-42多克隆抗体（ab10148）均购自Abcam公司；抗兔SP试剂盒（1/4）（SPN-9001）和DAB显色试剂盒（ZL I-9018）均购自北京中杉金桥试剂公司；抗兔IgG胶体金标记二抗（58-15-06）购自KPL公司。pH7.6，0.2mol/L PB液（Na2HPO4.12H2O：71.64g；NaH2PO4.2H2O：31.21g。定容至1000mL）；包埋剂（环氧树脂618：60％；DDSA：36％；DBP：3％；DMP-30：1％）。上述试剂依次加入，边加边搅拌，全部加完后磁力搅拌器15min，静置于35℃～40℃温箱内排除气泡。银增强液：SE-EM ACT IVATOR 40滴和SE-EM IN IT IATOR 1滴混匀后取一滴，与SE-EM ENHANCER 20滴再混匀即可。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色：取脑固定，切片：年轻组和老年组恒河猴实施安乐死后迅速断头取脑，分别取出额叶、海马、颞叶和顶叶，放入含30％蔗糖的4％多聚甲醛固定，直至沉底。分别进行连续冠状冰冻切片，切片厚40μm，入0.01mol/L PBST（0.01mol/L PBS，1％Triton）4℃保存，待染。

免疫组化染色（漂染）：70％甲酸抗原修复30min，ddH2O充分浸洗；3％双氧水消除内源性过氧化物酶活性10min（避光），PBST充分浸洗；5％脱脂奶粉封闭抑制非特异性染色30min，PBST浸洗。切片在1％BSA-PBS一抗孵育液中4℃过夜，抗体稀释浓度：抗βAmyloid 1-40多克隆抗体与抗βAmyloid 1-42多克隆抗体均为1∶200。浸洗后严格遵循抗兔SP试剂盒（1/4）说明进行二抗，三抗的孵育。不加一抗作为阴性对照。DAB显色，裱片，干燥，封片。光镜下，棕染有细胞形态的为阳性细胞。

1.2.2 免疫电镜灌注取材：取8号23岁恒河猴，称重7.5Kg，6％戊巴比妥钠（30mg/kg）静脉麻醉。开胸经左心室插管，0.01mol/L PBS（约需4000mL）灌流冲洗，然后用4％多聚甲醛（含3％戊二醛）灌流固定（约需4000mL），灌流完成后4℃静置1h后取脑。取出额叶、海马、颞叶和顶叶后置于4％多聚甲醛后固定8h，然后置于30％蔗糖（0.1mol/L PB）中待组织沉底。

1.2.3 免疫电镜：组织块经0.1mol/L PB充分浸洗，入0.5％NaBH4（0.1mol/L PB）20min（现用现配），0.01mol/LPBS充分浸洗，3％PBST（0.01mol/L PBS，3％Triton）浸洗20min，0.01mol/LPBS充分浸洗；6％羊血清（0.01mol/LPBS）封闭2h，无需浸洗直接入1％BSA-PBS一抗孵育液常温2夜。抗体稀释浓度：抗βAmyloid 1-40多克隆抗体与抗βAmyloid 1-42多克隆抗体均为1∶500；0.01mol/L PBS充分浸洗后入金标二抗稀释液中（0.01mol/L PBS，1∶50）孵育3h，0.01mol/L PB充分浸洗后，2％戊二醛（0.01mol/L PB）10min，0.01mol/L PB充分浸洗，入银增强液3h，0.01mol/L PB浸洗，1％锇酸（0.01mol/L PB）1h，0.01mol/L PB充分浸洗后依次置于50％酒精10min，70％酒精中待切片。不加一抗作为阴性对照。

组织块逐级脱水：70％酒精、90％酒精、1/2 90％酒精+1/2 90％丙酮混合液、90％丙酮、100％丙酮，依次间隔15min。

将包埋好的组织块修剪成塔形，尖端面积0.2mm×0.3mm左右，用超薄切片机切成50μm的切片，置于铜网上。电镜下，将对比度调到最大时仍可见的黑色颗粒为胶体金。

2 结果

2.1 免疫组化结果（图1～2见彩插3）

2.1.1 Aβ40的免疫组织化学染色：标记Aβ40的切片中，7岁猴可观察到神经细胞和胶质细胞中可见有少量的Aβ40颗粒，以额叶和海马居多（图1A，B），顶叶次之。老年猴中Aβ40聚集成团状斑块（图1E，F），神经细胞和胶质细胞中也见有Aβ40颗粒（图1C，D），颗粒密度与年轻猴未见明显差别，也以额叶和海马居多。

2.1.2 Aβ42的免疫组织化学染色：标记Aβ42的切片中，7岁年轻猴中细胞内未见明显的颗粒状Aβ42（图2A）。老年猴的额叶切片中可见Aβ42散在的斑块，多在细胞外（图2C）；神经细胞和胶质细胞内也见有Aβ42颗粒状沉积（图2B）；同时在老年猴的颞叶可见有明显的Aβ42形成的神经纤维缠结现象（图2D）。

2.2 免疫电镜结果（图3～5见彩插4）

2.2.1 Aβ40的免疫电镜结果：为了进一步观察Aβ沉积和分布的超微结构，我们选取23岁的恒河猴脑组织的上述四个部位进行免疫电镜分析，采用5nm的胶体金颗粒作为二抗。其中标记Aβ40的切片中，胶体金颗粒大部分存在于神经细胞胞浆中，也有少量存在于细胞核中。在细胞间质和小胶质细胞中也可见少量的胶体金颗粒，多见于额叶（图3）。

2.2.2 Aβ42的免疫电镜结果：标记Aβ42的切片中，标记上Aβ42的金颗粒比Aβ40的数量偏多。胶体金颗粒也是多见于神经细胞中，在小胶质细胞中也是少量存在，其中细胞外散在的胶体金颗粒数量也较多，多见于额叶和海马（图4）。

2.2.3 血管和神经纤维的Aβ沉积：Aβ40和Aβ42也普遍存在与血管内皮细胞周围，数量颇多；而且在颞叶的神经纤维束中也可见Aβ42标记的胶体金颗粒（图5）。

3 讨论

Aβ是由正常存在于细胞膜上的APP在β和γ蛋白酶的作用下水解形成的4×103左右的蛋白。除了APP基因突变造成的Aβ过量产生以外，Aβ自身的清除和降解代谢障碍也是Aβ沉积的重要原因。一项新的研究显示，Aβ可以抑制脑中大分子量蛋白酶的活性，从而使Aβ无法降解，这样Aβ就进入了一个沉积的恶性循环［7］。近年来，越来越多的研究证明，作为SP的核心成分，Aβ可以引起氧化应激、Ca2+内流，进而损伤线粒体，导致神经细胞产能障碍，激活凋亡相关蛋白和因子，最终启动细胞的凋亡过程。另外，Aβ还可以通过引起脑内炎症反应和NFT间接导致神经细胞凋亡。神经元凋亡，突触大量丢失，体现出整体上的神经功能障碍和行为学的改变。

在本研究中，采用免疫组织化学和免疫电镜方法研究Aβ40和Aβ42与年龄相关的变化特点。最近的研究表明，细胞内Aβ的颗粒状沉积只存在于老年个体和AD患者，而不存在于年轻非人灵长类动物的大脑［8-11］。然而，在本研究中，我们发现在年轻恒河猴的皮层神经元中也存在细胞内Aβ，并且Aβ40在年轻猴和老年猴中颗粒密度无明显差别。可能的解释就是本课题组采用了4％多聚甲醛固定组织，并且采用甲酸预处理脑组织，众所周知，多聚甲醛能够更好的保留固定组织和细胞表面抗原［12］且定期酸预处理能改善免疫反应。在年轻猴中，Aβ的存在形式更多是自然的颗粒性质，这表明在年轻猴神经细胞中的Aβ是处于生成和降解的平衡状态中，而不同于在老年猴脑组织中的细胞外积聚斑块。总之，我们发现，在年仅7岁的猴子皮层神经元存在弥漫性颗粒形式的细胞内Aβ，随着年龄的增长（19～24岁），出现明显的Aβ神经元簇或斑块形式，尤以Aβ42更为明显。年轻猴中细胞内未见明显的颗粒状Aβ42，但老年猴的额叶切片中可见Aβ42细胞外散在的斑块，神经细胞和胶质细胞内也见有Aβ42颗粒状沉积，并且在颞叶部位还可见明显的Aβ42NFT。Aβ42在年轻猴和老年猴中差异较大，可能与老年斑的形成过程有密切关系。

另外本研究采用免疫电镜观察亚细胞水平上Aβ的分布特点，采用5nm的金标二抗标记［13］，振荡切片后不经复染直接观察，在10000×镜下清晰可见胶体金颗粒。老年恒河猴脑中β淀粉样蛋白出现于不同的结构中，包括神经元、近端树突和轴索，也出现于血管周围和神经纤维中。β淀粉样肽还可出现于卫星细胞和小胶质细胞中，特别是当老年斑处于活跃状态时［14］。我们观察到Aβ40和Aβ42标记的胶体金颗粒均较多存在于神经细胞胞浆中，以额叶部位多见；而Aβ42在血管内皮细胞周围和神经纤维中也有一定数量。根据以上结果，在组织学和亚细胞学水平观察Aβ，均在额叶和海马部位发现较多沉积，并且在颞叶均标记出神经纤维缠结，Aβ的神经毒性作用以及由此产生的认知功能障碍可能与Aβ沉积部位有密切关系。额叶影响学习到的运动活动和表达行为，海马与记忆的形成和抑郁有关，颞叶的活动涉及视觉辨认、听觉感知、记忆与情绪，由此可见若Aβ在上述部位有较多沉积并产生神经毒性作用，阻断了神经轴突之间的信号传导，甚至导致神经细胞钙超载发生细胞凋亡［15］，必将影响认知功能。实验证明，二十多岁的老年猴能呈现类似人类的老年化行为和机体的退变，例如行动迟缓，记忆力减退，血管硬化等［16］。如何将恒河猴中Aβ的变化特点与临床AD患者的Aβ特点进行相关性联系，还需要有一系列工作要做，这也能够为临床上AD确诊和药物临床应用提供更恰当的依据。

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