结肠癌患者化疗/热化疗前后CD4+CD25+T细胞和CTL变化

施怡 李晓斌 章岳山 李勇 房定珠

1.上海市浦东新区公利医院肿瘤科，上海 200135；2.上海市普陀区利群医院肿瘤科，上海 200333；3.上海市交通大学医学院附属新华医院儿内科，上海 200092

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，全球范围发病有上升之势。结肠癌的治疗仍以手术及术后化疗为主。许多研究已证明结肠癌患者尤其是术后及化疗的患者机体免疫功能明显低下。如能改善患者的免疫功能，对结肠癌患者的预后会有极大的帮助。化疗/热化疗是内科治疗结肠癌的重要手段，化疗是通过药物直接达到杀伤肿瘤细胞的作用，热疗是通过热效应清除体内的肿瘤细胞。除热疗本身对肿瘤细胞的杀伤而达到降低肿瘤负荷外，刺激机体抗肿瘤免疫，降低肿瘤细胞的免疫耐受也在治疗中起着非常重要的作用。CD4+CD25+调节性T细胞（T regulatory cells，Treg）是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群。近来的研究表明CD4+CD25+Treg细胞能够显著抑制免疫反应，导致肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，并产生免疫耐受。本研究通过检测结肠癌患者化疗/热化疗前后外周血CD4+CD25+Treg细胞水平的变化以及对CTL细胞杀伤功能的检测，旨在探讨热化疗和化疗对肿瘤患者免疫耐受状态和机体抗肿瘤免疫作用的改善情况及CTL细胞杀伤功能变化。

1 资料和方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 收集上海市浦东新区公利医院肿瘤科2008年1月—2009年12月就诊的Ⅲ期结肠癌患者60例临床资料，其中男性56例，女性4例，年龄35～71岁，平均（56.5±7.3）岁。组织学类型：管状腺癌（浸润溃疡型）52例，黏液腺癌8例；分级：低分化55例，中-高分化5例，均经病理学或细胞学证实。均行超声、CT等各项辅助检查。根据1997年国际抗癌联盟标准进行临床分期：ⅢA期48例，ⅢB期8例，ⅢC期4例。所有患者全身功能状态评分（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）0～3分，外周血白细胞＞3.5×109个/L，血小板＞100×109个/L，肝肾功能正常。

1.1.2 手术情况 所有患者均行根治性手术切除。排除标准包括：⑴有自身免疫性疾病史（包括AIDS和病毒性肝炎等）；⑵既往接受过同种异体骨髓移植者；⑶使用免疫抑制剂（如泼尼松、硫唑嘌呤等）；⑷患有其他恶性肿瘤者；⑸急、慢性感染者。其中30例患者接受奥沙利铂135 mg/m2，第1～5天，5-FU 375 mg/m2，第1～5天+CF 200 mg/m2，第1～5天，化疗方案治疗6个疗程，另30例患者接受上述同样化疗方案+热疗治疗6个疗程。热疗方法：通过UHR-200微波聚束肿瘤治疗仪腹腔局部加热使全身体温升至40～41 ℃，在每个化疗疗程期间第1、5天治疗2次，每次治疗功率500～800 w，治疗时间60 min。

1.1.3 试剂 PreCP标记鼠抗人CD3、FITC标记鼠抗人CD4、PE标记鼠抗人CD8、PE-Cy5标记鼠抗人CD25和PE标记鼠抗人TCRγδ、同型对照分别为FITC标记抗鼠IgG、PE标记抗鼠IgG、PreCP标记抗鼠IgG和PE-cy5标记抗鼠IgG购于美国BD Pharmingen公司，采用FACS 流式细胞仪（BD FACS Calibur）检测。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪分析 采用直接免疫荧光标记法制备被检测样品：新鲜的肝素钠抗凝分离获取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），每管加细胞100 μL，分别直接加入10 μL PreCP标记鼠抗人CD3、FITC标记鼠抗人CD4、PE标记鼠抗人CD8、PE-Cy5标记鼠抗人CD25和PE标记鼠抗人TCRγδ，连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应，同时加入FITC标记抗鼠IgG、PE标记抗鼠IgG、PreCP标记抗鼠IgG和PE-cy5标记抗鼠IgG用来作为同型对照，并充分混匀，于室温中温育30 min后，用PBS（pH：7.2～7.4）洗1～2次，加入0.4%多聚甲醛-PBS缓冲液重悬细胞，上FACS流式细胞仪检测后，用CELLQuest软件进行数据分析。

1.2.2 CTL细胞杀伤功能的测定 用含0.5%FBS的RPMI-1640培养液将肿瘤靶细胞调整到2×105个/mL， CTL效应细胞调整到2×106个/mL，在96孔圆底细胞培养板中加入靶细胞和效应细胞，每孔加100 μL，每组3个复孔。并设效应细胞自然释放对照孔，靶细胞自然释放对照孔和靶细胞最大释放孔。置37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养4～6 h。200 ×g离心10 min。每孔吸出50 μL上清液，对应加入另一块96孔酶联检测板中，并加入LDH基质试剂50 μL，室温中放置30 min，再加入终止试剂50 μL。在酶联检测仪上测定各孔的光密度（A值），检测波长492 nm。特异性杀伤活性的计算：杀伤活性（%）＝［（A实验组－A总自然释放）/（A最大释放组－A总自然释放）］×100%。

1.3 统计处理 实验数据以（x±s ）表示，用SAS8.1软件进行处理。资料服从正态分布，统计分析采用单因素方差分析法；对于治疗前、后CD4+CD25+Treg细胞的水平，用多样本均数间两两比较的SNK（Student-Newman-Keuls）检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 治疗前后CD4+CD24+Treg细胞水平 单纯化疗组治疗前后CD4+CD25+Treg细胞水平分别为19±9和19±7，两者比较无统计学差异（F=0.026，P=0.872）。化疗联合热疗组治疗前后19±5和15±4，两者比较差异有统计学意义（F=7.198，P=0.012）。

2.2 治疗前后CTL细胞活性 单纯化疗组治疗前后CTL细胞活性分别为10±3和15±5，两者比较，差异有统计学意义（F=189.807，P=0.003）。化疗联合热疗组治疗前后12±3和18±5，两者比较，差异有统计学意义（F=236.097，P=0.001）。

3 讨 论

肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞的免疫逃逸和免疫耐受密切相关［1］。Sakaguchi等［2］先前发现鼠源性的CD4、CD25双阳性T细胞亚群，无论在体内或是体外均表现独特的抑制功能，这为调节T细胞的研究提供了一个较为可靠的标志。CD4+CD25+Treg细胞在多种肿瘤患者的外周血和肿瘤组织中均有增高［3-4］，提示肿瘤细胞可能通过某种机制诱导了的增殖和分化，同时其水平的增加可以促进肿瘤的生长，抑制抗肿瘤免疫效应［5］。CD4+CD25+Treg细胞可能是参与肿瘤微环境中抑制免疫应答的细胞之一，了解化疗及热化疗前后结肠癌患者外周血CD4+CD25+Treg细胞水平及CTL功能，对评价患者的免疫状态有很高的价值。奥沙利铂联合5-FU是临床常用的治疗结肠癌的化疗方案之一。化疗大多是通过药物诱导细胞凋亡杀伤靶细胞。但另一方面可以导致淋巴细胞减少，使机体的免疫功能受到损伤。本研究通过30例结肠癌患者化疗前后和30例结肠癌患者热疗联合化疗治疗前后外周血CD4+CD25+Treg细胞水平检测，发现两组结肠癌患者治疗前CD4+CD25+Treg细胞水平相似，两组比较差异无统计学意义。单纯化疗组治疗后CD4+CD25+Treg细胞水平均未见明显变化，但化疗联合热疗组治疗后CD4+CD25+Treg细胞水平下降（P＜0.05）。两组CTL细胞杀伤功能治疗后均明显增强，以化疗联合热疗组增强更明显，差异有统计学意义。其原因可能是有效的化疗能够导致肿瘤的减灭，从而改变效应细胞与靶细胞的比率，使CTL杀死靶细胞的能力得到增强［6］。化疗直接通过杀伤肿瘤细胞降低肿瘤负荷，但会造成对机体的免疫损伤；而热疗对化疗有热增敏作用，使患者体内的肿瘤细胞减少更明显，本研究观察到化疗联合热疗组CD4+CD25+Treg细胞水平明显降低、CTL活性增强，除热作用外，热疗诱发的机体抗肿瘤免疫效应也具发挥了重要的作用。Kubista等［7］用热疗治疗骨肉瘤和软骨肉瘤，发现热疗后有NK细胞介导的杀瘤活性增加，而NK细胞的非特异性免疫，对控制肿瘤的生长、杀灭血液循环中的肿瘤细胞、防止及减少血行播散起着重要作用。热疗诱发机体免疫的机制有：提高免疫效应细胞的活性、诱导免疫效应细胞再分布、解除免疫抑制因子的抑制作用、非特异性炎症诱导的免疫反应、改变肿瘤免疫原性等。本研究结果提示化疗联合热疗可明显改善患者的免疫抑制状态，增强细胞毒T淋巴细胞的活性，从而可能会减轻化疗对机体的免疫损伤，化疗联合热疗可能提高患者疗效和预后。

［1］ 高强, 邱双健, 樊嘉.CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞在肿瘤免疫逃逸中的作用研究进展［J］.中国癌症杂志,2007, 8(17)： 657-663.

［2］ Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al.Immunologic self-tolcrance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25)： Breakbown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases［J］.J Immunol, 1995, 155(3)： 1151-1164.

［3］ Okita R, Saeki T, Takashima S, et al.CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood of patients with breast cancer and non-small cell lung cancer［J］.Oncol Rep, 2005, 14(5)：1269-1273.

［4］ Wolf AM, Wolf D, Steurer M, et al.Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients［J］.Clin Cancer Res, 2003, 9(2)： 606-612.

［5］ Terabe M, Berzofsky JA.Immunoregulatory T cells in tumor immunity［J］.Curr Opin Immunol, 2004, 16(2)： 157-162.

［6］ Lake RA, van der Most RG.A better way for a cancer cell to die ［J］.N Engl J Med, 2006, 354(23)： 2503-2504.

［7］ Kubista B, Trieb K, Blahove H, et al.Hyperthermia increases the susceptibility of chondro and osteosarcoma cells to natural killer cell-mediated lysis［J］.Anticancer Res, 2002,22(2A)： 789-792.