组织和细胞中Ca2+浓度测定方法的研究进展

边 原，肖洪涛，陈 璐

Ca2+在人体内不但具有重要的生理作用，在组织或细胞产生病理反应时其浓度还能反映病灶的病变程度，它作为细胞内的信息传递物质，具有调节细胞功能、参与信号跨膜传递以及介导细胞对外界刺激的应答反应等重要作用［1］。因此，组织或细胞内Ca2+浓度测定方法的研究和改进，对临床和药学相关实验研究具有重要的意义［2］。

1 45Ca 跨膜流动测定方法

同位素45Ca(T0.5=163 d，β射线能量为0.25 MeV)与生物体中的Ca2+具有相同的生物活性，由于45Ca发出的β射线能被探测，因此只要测量45Ca进入细胞内的数量变化就可快速、直观地反映出药物对Ca2+通道的阻滞特性。平滑肌细胞膜上一般存在有3种Ca2+通道:① 静流钙通道;②受体钙通道;③电压依赖钙通道。欲真实测量通过每一种钙通道进入细胞中45Ca的量，必须除掉在细胞膜外面的全部45Ca。该法采用冷EGTA络和法测量45Ca进人细胞的量，既能除去细胞外的45Ca2+，又能确保已进人细胞中的45Ca2+不重新流出细胞外。国内有研究者［3-4］将此方法用于动物组织包括心肌、主动脉等所含的Ca2+进行测定，效果较好，同时为中药对钙通道的影响提供了较好的方法，具有用样少、操作简便、快速灵敏、重现性好等优点。

2 X射线微区分析方法

X射线微区分析技术利用电子束轰击样品，产生特征X射线。特征X射线是入射电子激发外层电子释放的，其能量和波长为每种离子所固有，通过这种特性就有可能进行元素定性分析，进行定量分析的基础在于特征X射线的强度与样品中所含元素的浓度有关。目前X射线微区分析技术能够成功地用于测量细胞内肌浆网和内质网等细胞器所含的Ca2+浓度［5］。有研究发现细胞内内质网上的钙库具有非均匀性。研究者通过电刺激海马神经元树突发现一些内质网囊状结构的Ca2+浓度出现非常强劲的增长，同时其它一些囊状结构却没有应答反应［6］。目前此研究法在形态学识别细胞器内Ca2+浓度方面具有最高的分辨率。

3 离子选择微电极方法

离子选择性微电极(ISME)是一种能测定细胞等生物微环境内单一离子活度的信息传感器，其主要特点是微型化，尖径在1 μm内，能在不损伤细胞的情况下，直接插入单个细胞内，运用电位测定法测定细胞内的离子浓度。所以IMSE对研究细胞的生理功能十分重要，目前广泛应用于生物医学、临床检验和药物分析等。杨红芸等［7］利用自制Ca2+选择性微电极建立血清样品中Ca2+测定方法，研究结果表明Ca2+-ISME可用于内源性药物钙制剂的药物代谢动力学研究。

4 核磁共振波谱方法

核磁共振(NMR)波谱方法是无损伤研究生物样本的重要手段，能够在接近生物样本生理状态下连续动态地进行检测［8］。19FNMR是细胞内Ca2+测定的非光学方法，由于正常生物体内含氟成分少，为了得到足够的响应，在检测游离Ca2+浓度时使用含氟指示剂，目前常用的指示剂为nF-BAPTA［n fluoro-1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N′，N′tetraacetic acid］衍生物。nF-BAPTA需经过乙酰氧甲酯的化学修饰(nF-BAPTA-AM)才能进入细胞内，之后水解成为游离酸形式，与细胞内游离Ca2+结合形成螯合物Ca2+-nF-BAPTA。根据所形成的螯合物解离常数(Kd)不同，可分为快交换型5F-BAPTA和慢交换型4F-BAPTA。用核磁共振检测快交换型的5F-BAPTA在NMR波谱图上得到其结合和未结合Ca2+型2个峰，由两峰的峰面积比和Kd，可计算细胞内游离Ca2+浓度;对于慢交换型的4F-BAPTA会出现单峰，利用结合与未结合Ca2+型的化学位移计算Ca2+浓度［9］。

5 原子吸收分光光度法测定方法

原子在一般情况下处于能量最低状态(基态)。当原子吸收外界能量被激发时，其最外层电子可跃迁到较高的不同能级上(激发态)。处于激发态的电子很不稳定，一般在极短的时间便跃回基态，此时原子以电磁波的形式放出能量。原子吸收分光光度法是基于光源辐射出具有待测元素特征波长的光通过试样原子蒸气时，被蒸气中待测元素的基态原子所吸收，然后利用光被吸收的程度来测定待测元素的含量。它具有测定灵敏度高、检出限小、干扰少、操作简单、快速等优点。毛亚伦等［10］利用原子吸收分光光度法、荧光指示剂法以及细胞膜酶活性法研究感染严重程度与红细胞膜钙泵、细胞内外Ca2+浓度关系，结果表明感染患者存在细胞外Ca2+向细胞内流动，导致细胞功能紊乱、损害甚至死亡。

6 荧光指示剂测定方法

荧光指示剂测定法是用具有特异性与细胞内游离钙离子结合的荧光探针或染料，以其与钙离子结合后荧光强度所发生改变通过成像、激光共聚焦显微技术等测算细胞内Ca2+含量的一种方法，目前应用较为广泛，常用于测定细胞内各种细胞器Ca2+含量。

6.1 线粒体中［Ca2+］的测量 目前线粒体中Ca2+浓度的测量最广泛应用的荧光指示剂为Rhod-2。在乙酰氧甲酯的作用下，Rhod-2带有的正电荷，可使该指示剂在线粒体中优先累积。经脱酯后指示剂散落在线粒体中，并且在线粒体囊腔中显示 Ca2+浓度［11］。

Rizzuto等［12］首先成功的将生物发光蛋白-水母荧光素定位线粒体中的Ca2+。利用定位线粒体Ca2+的指示剂发现在血管壁内皮细胞内存在大量的Ca2+，并且线粒体Ca2+的浓度迅速发生变化定位线粒体外叶的水母荧光素显示，在以肌醇三磷酸(IP3)介导的从内质网释放的Ca2+过程中，线粒体比其它细胞器更易于接收到较高的Ca2+信号［13］。Montero等［14］使用与线粒体内Ca2+具有不同亲合性的水母荧光素，并和不同类型的荧光素发光底物腔肠素重新组合，能够扩大Ca2+浓度测定的线性范围。近年来，科学家开始用人工荧光蛋白cameleon、pericam以及camgaroo等来进行Ca2+的浓度测量。此类研究方法以相应的cameleon为基础表现出线粒体指示剂的定位以及对Ca2+的敏感程度。此外该研究还使用新型工艺，在内质网和线粒体内产生有关Ca2+循环的在概念方面的重要消息［15］。Rodolf等［16］在生理条件下用指示剂cameleon对骨骼肌中的Ca2+进行测量，此方法使用了双光子显微技术，解决了线粒体中Ca2+浓度迅速变化而测定不准的问题，并具有特异性。

6.2 内质网中［Ca2+］的测定 内质网是Ca2+释放的重要细胞器，其所含的Ca2+已经成功的被所有类型的光学Ca2+探针(包含天然水母荧光素、人工荧光蛋白以及低分子量的荧光指示剂)在内质网的管腔内所捕捉到。Demaurex等［17］通过研究发现应用光学钙离子探针能够很成功的快速定位和固定内质网内的Ca2+。此法相比之前的探针方法有了很大的改进。cameleon蛋白的荧光共振能量转移效率不会影响Ca2+的生理浓度。新型cameleon具有适合内质网Ca2+测量的Kd值以及具有合理的动态范围。将钙网硬蛋白信号序列以及内质网保留信号(KDEL)添加到cameleon Design 1(D1)中，从而形成以内质网 Ca2+为目标的 cameleon(D1ER)。Palmer等［18］指出 D1ER在内质网 Ca2+测量的敏感度方面提供了相当大的改善，要比以往的 cameleon YC4.3ER要优越。D1ER与Fura-2的完美结合，可以用来同步测量各种比例的细胞溶质和内质网所含的Ca2+。

Hofer等［19］最早使用低分子量钙指示剂测定内质网所含Ca2+浓度。低分子量钙指示剂Mag-Fura-2的乙酰甲氧酯在胞液和细胞内间隔中积累，随后通过洋地黄或人参皂苷对Ca2+作用，使Ca2+经由质膜选择性渗透释放出来，随后与指示剂作用通过荧光强度得出结果［20］。Park等［21］使用整体单元形状贴片夹具方法用来除去细胞溶质的指示剂。此法可以在内质网的细胞腔中对Ca2+浓度的动态变化进行记录并保存质膜的完整性。

20世纪90年代初，Kendall等［22］最早开始尝试研究可用于内质网Ca2+测量的水母荧光素。由于水母荧光素亲合性低，研究者尝试不同类型的荧光素发光底物进行改进。使得该技术可以用于内质网钙的测量。Demaurex等［23］通过方法改良以及半合成技术研究出人工水母发光蛋白嵌合体，能够适合于在肌浆网细胞腔中对Ca2+进行测量。

6.3 内体(endosome)以及溶酶体中［Ca2+］的测量 Ca2+在内体以及溶酶体运输过程中具有重要作用。Ca2+指示剂BAPTA可以快速与细胞溶质内的Ca2+进行螯合，从而可以抑制初级内体的融合作用。Pryor等［24］研究发现一些Ca2+指示剂还可以抑制次级内体与溶酶体酶的运输小泡的融合作用。目前常使用低亲合性钙指示剂Oregon Green 488 BAPTA-5N测量内体中Ca2+的浓度，此指示剂在初级内体中具有一定程度的耐酸性［25］。研究发现初级内体的Ca2+浓度相对较低，Ca2+损失与细胞器酸化有密切关系。Christensen等［26］使用Fura-2右旋糖苷以及 Oregon Green BAPTA-1右旋糖酐指示剂测定Ca2+，发现来自内体的Ca2+的溢出可能参与细胞器早期的酸化作用。次级内体以及溶酶体的Ca2+浓度远超过初级内体的Ca2+浓度。

进一步研究发现次级内体以及溶酶体的相对较高的Ca2+浓度需要细胞器内的蛋白具有一定的酸性pH值。加入扰乱溶酶体的酸性因子可以导致细胞器蛋白内Ca2+的急剧减少。这说明只要细胞器的酸性化程度充分，H+/Ca2+交换便可能积累相当数量的Ca2+并且可以作为细胞器的Ca2+信号源［27］。

6.4 细胞核内［Ca2+］的测量 Ca2+离子在细胞核的生命进程中具有重要调节作用，包括基因表达，DNA复制、蛋白的磷酸化作用，细胞周期和细胞凋亡的调节作用［28］。外部核膜与内质网膜极其相似，事实上它是内质网薄膜的延长部分。核膜的胞腔与内质网相连，而内部核膜的成分与外部的核膜不同。细胞核通过内质网型Ca2+-ATP酶积累Ca2+。核膜包含钙结合蛋白钙网硬蛋白以及钙释放渠道InsP3Rs、毒蔁碱受体、兰尼碱受体等［29-30］。细胞核是一种很大的细胞器，可以通过荧光Ca2+敏感指示剂和共聚焦显微技术与细胞质区分出来。目前低分子量指示剂广泛用来测定Ca2+并比较细胞核与细胞质中Ca2+的信号差异［31］。

通过细胞核定位信号，将具有荧光性的Ca2+感应蛋白cameleon定位到细胞核中［32］。改良的 cameleon降低了对pH的敏感度，其镶嵌于具有特异性的神经元表达序列被成功的引入到下丘脑部分神经元中，这一过程显示Ca2+在细胞核和胞质调节方面存在着一定的差异［33］。Nagai等［34］使用pericam指示剂来监测Ca2+在人子宫颈癌传代细胞的细胞核中的浓度变化，并且对线粒体初期Ca2+变化进行比较。pericam指示剂还用于与细胞质和线粒体指示剂相结合的心肌细胞中，该研究显示了细胞区室中的同步Ca2+浓度震荡过程［35］。

7 总结

通过对组织和细胞内Ca2+浓度的动态监测与准确测定，能更深入的认识许多生理和病理过程，对与Ca2+参与的相关药物作用机制的研究有极其重要意义。Ca2+测定方法不同，同种方法所用的指示剂又不尽相同。但每种测定方法都有其独特的优点，因此实验前应根据个人的实验目的仔细选择正确、简便、经济的检测方法，以及合理和现有的指示剂与信号检测仪。通过严谨科学的实验设计，以最终获得成功的实验结果。

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