盾叶薯蓣组培快繁技术研究

梁艳丽，赵庆云，谢世清

（云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明，650201）

盾叶薯蓣 （Dioscorea zingiberensisC.H.Wright）是薯蓣科薯蓣属的一种多年生缠绕性草质藤本植物[1]，是重要的药源植物，其主要有效成分薯蓣皂甙元是合成甾体激素类药物长效口服避孕药皮质激素及抗休克等药物的主要原料，国内外需求量很大。由于过度采挖，其野生资源已濒临枯竭，进行人工栽培是发展盾叶薯蓣产业的必由之路[4]。盾叶薯蓣人工栽培主要采用以根状茎作种的无性繁殖手段。这种繁殖用种量大，繁殖系数很低，繁殖的速度和数量难以满足实际生产需求。加之根状茎本身即是盾叶薯蓣的经济器官，采用根状茎繁殖造成盾叶薯蓣繁殖成本居高不下[5]。为加速盾叶薯蓣在农业生产中的推广应用，并节约农业生产成本，采用植物组织培养技术对其进行种源快繁是一条有效的途径[6]。本文通过对外植体的选择、诱导培养基、增殖培养基及生根培养基的研究，旨在为盾叶薯蓣快繁育苗体系的建立提供一定的技术及理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试材为由云南农业大学魔芋研究所提供的盾叶薯蓣优良品系盾薯38。取温室大棚栽植的植株幼叶、带节茎段和根状茎作为外植体。

1.2 试验方法

材料取回后，先用清水浸泡15～25 min，用洗衣粉水清洗，再用自来水漂洗，用蒸馏水冲洗3～5次备用。在无菌操作台上，无菌条件下用75%酒精浸洗30 s，蒸馏水冲洗2次，再用0.1%升汞浸泡3～5 min，蒸馏水清洗4～6次，切成大小适宜的小块，即可接种。

诱导培养基和增殖培养基均以MS为基本培养基，生根培养基以1/2 MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA和NAA。培养基的pH值为5.8，琼脂浓度为6.5 g/L。培养基于121℃灭菌20 min。培养温度为（25±2）℃，光照条件为每1 m240 W节能灯管2根，每天光照时间为12～14 h。

2 结果与分析

2.1 不同外植体灭菌效果的比较

从表1可以看出，在相同条件下，不同外植体的污染率存在较大差异，根状茎的污染率最高，为60%，而茎段的污染率最低，仅为20%，幼叶的污染率介于二者之间。但由于幼叶较为柔嫩，对灭菌药品的耐受能力较差，灭菌处理后，多数叶片都出现焦枯现象，死亡率较高，因此，灭菌效果最好的外植体为带节茎段。且在试验过程中发现，带节茎段在接种30 d后，长出的腋芽和不定芽较多，诱导效果明显好于幼叶和根状茎，因此带节茎段为最佳外植体。在后续的试验中，均以带节茎段作为外植体进行操作。

2.2 不同浓度的6-BA与不同浓度的NAA配比对盾叶薯蓣茎段芽诱导的影响

本试验以带节茎段作为外植体，设计了10种培养基对其进行芽诱导。接种5 d后，部分处理在茎切口处即开始显现绿色，25 d后各处理先后出现不定芽，接种30 d后统计结果。从表2可以看出，不同的激素以及不同的浓度诱导效果有较大的差异。从1号和2号培养基的比较中可以看出，在6-BA均为2 mg/L时，在培养基中添加NAA有助于诱导成功，诱导率提高了10%。在NAA浓度为0.20 mg/L时，随着6-BA浓度的增加，诱导率反而呈现下降趋势，说明高浓度的6-BA并不利于外植体的分化。且在试验过程中发现，6-BA浓度过高时，芽个体变小，芽色变白，玻璃化现象较为严重。在6-BA浓度均为3 mg/L的情况下，随着NAA浓度的增加，诱导率有上升的趋势，但当NAA浓度大于0.5 mg/L时，表现出明显抑制生长的现象，体现了生长素低浓度促进生长，超高浓度抑制生长的特性。从10种培养基的比较中可知，较低浓度的6-BA和适宜浓度的NAA对茎段外植体的芽诱导有明显的促进作用，其中，以2号培养基诱导效果最好，诱导率最高，达到70%，因此最佳诱导培养基应为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.20 mg/L（表 2）。

表1 不同外植体灭菌效果比较

2.3 不同浓度的6-BA与不同浓度的NAA配比对盾叶薯蓣增殖的影响

外植体诱导30 d后，即可进行继代增殖培养。将诱导产生的芽转接到增殖培养基上5 d后，均有明显的增粗和伸长，15 d后有丛生芽出现。转接30 d后统计增殖系数。

从表3中可知，参照前序试验而制定的6种培养基对盾叶薯蓣的增殖效果均较好。6-BA在1～2 mg/L，NAA在0.1～0.3 mg/L的范围增殖系数均较高，在3.0～6.0。但不同激素浓度配比对增殖效果的影响还是有所差异的，当6-BA浓度为2 mg/L时其平均增殖系数为5.3，当6-BA浓度为1 mg/L时其平均增殖系数为3.6，说明适当增加6-BA浓度有利于盾叶薯蓣组培苗的增殖。同时，NAA浓度的变化对增殖效果也产生了明显的影响，当6-BA浓度不变时，随着NAA浓度的增加，出芽数呈明显下降趋势，说明高浓度的NAA会抑制盾叶薯蓣不定芽的产生。试验过程中还发现，低浓度的6-BA条件下虽然增殖系数偏低，芽生长速度较快，易于成苗，但苗较为纤细；高浓度的6-BA虽然有利于提高增殖系数，但幼苗生长较慢，出苗时间长，苗更为健壮。综合以上因素，盾叶薯蓣不定芽增殖的最佳培养基应为4号培养基，其增殖系数达到6.0。增殖效果最差的培养基为3号培养基，增殖系数最低，为3.0。因此，最佳增殖继代培养基应为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

表2 不同激素浓度配比对盾叶薯蓣芽诱导的影响

表3 不同激素浓度配比对盾叶薯蓣组培苗增殖的影响

2.4 不同浓度的NAA对盾叶薯蓣生根的影响

待增殖芽苗高于4 cm时即可进行生根培养。本试验以1/2 MS为基本培养基，附加不同浓度的NAA进行生根培养。转接10 d后，部分培养基上即有根原基出现。发根初期，不定根附着于培养基的表面，随后逐渐深入培养基内部，并逐渐形成须根。不同NAA浓度的培养基在组培苗发根的早迟、生根率等方面均存在较大差异。从表4可以得出，在这6种培养基中，以3号培养基发根最早，5号和6号培养基发根最迟。生根株数也以3号培养基最多，为26株。

随着NAA浓度的增加，试管苗生根率有所增加，说明NAA的确有诱导生根的良好作用。但当NAA浓度高于0.5 mg/L时，生根率呈现迅速下降趋势。这一规律说明，NAA只有在适宜浓度的条件下才有利于盾叶薯蓣组培苗的生根。综合发根时间、生根率及根系生长情况得知，在参试的6种培养基中，以3号培养基生根效果最好，不仅生根率最高，为87%，且发根早，根系粗壮，白净，须根最多。因此，盾叶薯蓣最适生根培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。

表4 不同NAA浓度对盾叶薯蓣生根的影响

3 讨论

3.1 外植体的选择

在盾叶薯蓣的离体培养中，外植体的选择非常重要。为了提高诱导率，一般选择植株的幼嫩部分作为组织培养的外植体[9]。植物组织幼嫩，生命力强，有利于诱导和分化[10]。但幼嫩部分往往对消毒的耐受能力较差，导致弃材率较高，诱导效率不高，如本试验中的幼叶。本试验采用相对较成熟的带节茎段作为外植体，比用幼叶的诱导效果好，诱导率较高。而根状茎深埋于土层当中，内部可能带有细菌和病毒，所以导致灭菌不彻底，污染率最高，不适宜作为盾叶薯蓣组培快繁的外植体。

3.2 生根的问题

本试验最高生根率为87%，最低生根率为20%，与前人的100%的生根率相比有一定差距。生根率偏低可能与在培养基中没有添加细胞分裂素类物质有关。因考虑到细胞分裂素利于芽的分化，生长素利于根的分化的特点，在培养基设计时，为了提高培养基中生长素与细胞分裂素的比值，利于生根，就仅在培养基中加入生长素而没有添加细胞分裂素。但细胞分裂素的缺乏可能导致细胞分裂受抑制，从而表现为生根率不高。在后续的试验中还需进一步考察培养基中添加6-BA对盾叶薯蓣生根的影响。

4 结论

由试验结果可知，在幼叶、茎段和根状茎的比较中，带节茎段是最适宜的外植体。以茎段作为外植体的最佳诱导培养基为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.20 mg/L。最佳增殖继代培养基应为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。盾叶薯蓣最适生根培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。

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