ARIP1,2在小鼠 Neuro-2a细胞中的表达研究

陈芳芳, 刘海岩, 王轶楠, 李 楠, 葛敬岩, 柳忠辉, 高振平

激活素 A(Activin A)属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员的多功能生长和分化因子,具有促进垂体前叶腺细胞分泌促性腺激素、诱导中胚层发育以及抑制活化巨噬细胞分泌 NO等功能,还具有维持神经细胞生存作用,因此也称作神经细胞生存因子[1～3]。近年的研究发现,在细胞内存在一组新的激活素信号传导调控蛋白,命名为激活素受体相互作用蛋白(Activin Receptor-Interacting Protein,ARIP),ARIPs可特异结合激活素 II型受体,调控激活素诱导的细胞内信号传导[4～6]。我们前期研究揭示 ARIP1,2均在脑组织表达[7,8],但其在神经细胞的表达调控及其作用是否存在差异,仍无相关报道。本研究采用实时定量 PCR、免疫细胞化学染色以及激活素信号传导分析体系,探讨 ARIP1,2在小鼠神经细胞中的表达及作用的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 实时定量 RT-PCR试剂盒购自Takara公司。免疫细胞化学染色用 Ultrasensitive SP超敏试剂盒购自福建迈新公司。

1.2 方法

1.2.1 实时定量 PCR 根据 GenBank登录的ARIP1(AB029485)及 ARIP2(AY157057)序列设计引物:ARIP1正向引物:5'-TTGGACTACAGGCAGCACTCT-3',反向引物:5'-GTTCGTCGTGTCTTTAGGGT-3';ARIP2正向引物:5'-GTCAGCCGTATCAAAGAGGATG-3',反向引物:5'-CTTGTGGCAATACTTCTCTGGTG-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用 Trizol试剂提取神经瘤细胞系 Neuro-2a细胞总RNA,取 500ng总 RNA进行逆转录,取 1μl逆转录产物进行 SYBR荧光定量RT-PCR,操作按试剂盒说明书进行。反应条件:stage 1:95℃ 10s,1个循环;stage 2:95℃ 5s,60℃31s,40个循环,此阶段进行荧光采集;stage 3:95℃15s,60℃ 1min,95℃ 15s,1个循环。根据 mRNA标准曲线计算样本中的 mRNA量。

1.2.2 免疫细胞化学染色 取单层培养的Neuro-2a细胞,4%多聚甲醛固定 24h,PBS洗涤 2次;1%H2O2甲醇液处理 30min,PBS漂洗 3次;0.25%Triton X-100/5%DMSO溶液中孵育 10min,PBS漂洗 3次;滴加 5%BSA,室温,放湿盒中封闭1h;滴加抗 ARIP1或 ARIP2抗体(1∶200稀释)[7,8],4℃过夜,采用 Ultrasensitive SP超敏试剂盒进行染色,DAB显色,细胞经苏木精复染,自来水冲洗,常规梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,树脂封片,光学显微镜观察。实验以未免疫兔血清 IgG做阴性对照,实验操作同抗体组。

1.2.3 ARIP1,2介导的 Activin特异基因转录活性分析 为了研究 ARIP1,2能否影响 Activin诱导的信号传导,实验选择只对 Activin特异应答的CAGA-lux质粒提供荧光素酶报告基因。采用 Lipofectamine 2000(Invitrogen公司产品)将 CAGA-lux、CMV-gal(用于荧光素酶活性标准化计算)及 pcDNA3-ARIP1或 pcDNA3-ARIP2和 pcDNA3-Smad3质粒共转染体外培养的 Neuro-2a细胞,按照文献的方法采用 5ng/ml Activin刺激、并检测细胞内报告基因转录荧光素酶的活性。

2 结 果

2.1 实时定量 RT-PCR分析 ARIP1,2在 Neuro-2a中的表达 检测结果显示,在正常对照 Neuro-2a细胞中 ARIP1,2 mRNA均表达,但以 ARIP1表达明显。采用细菌脂多糖(LPS)刺激后,ARIP1,2 mRNA表达均明显增强。

2.2 免疫细胞化学染色分析 ARIP1,2蛋白在Neuro-2a中的表达 染色结果进一步显示,ARIP1,2在 Neuro-2a中均表达,LPS刺激后,ARIP1,2表达均明显增强。

2.3 基因转录活性分析 实验进一步在神经细胞 Neuro-2a检测 ARIP1,2介导 Activin信号传导作用。结果显示,过表达 ARIP1,2对 ActivinA诱导的基因转录活性均产生抑制作用,ARIP1还能抑制Smad3诱导的基因转录活性,而 ARIP2对 Smad3诱导的基因转录活性没有影响。

3 讨 论

激活素受体分为 ActRI及 ActRII,Ⅱ型受体又分为ⅡA、ⅡB两个亚型(ActRⅡA和 ActRⅡB),由各自的基因编码。激活素受体在多种组织表达,但ActRIIA受体的 ActRIIAN型突变体,主要表达在脑神经组织。20世纪 90年代中后期,人们相继证实Activin、TGF-β等 Ser/Thr激酶型受体胞内信号传导与 Smad信号传导蛋白家族有关,2000年又报道了一组新的激活素受体胞内信号传导调控蛋白-ARIP,至今发现 ARIPs存在 4种以上分子形式。ARIP和Smad蛋白不同,ARIP家族蛋白只作用于激活素信号传导途径,而且其分布存在组织学差异。目前的研究表明 ARIP1具有 5个 PDZ样功能区,存在于细胞膜上或膜下区,通过 PDZ5与 ActRII结合。不同于 ARIP1,ARIP2只有一个 PDZ样功能区,也可与ActRII受体的 C末端结合,通过 Ral/RalBP1依赖的途径,调节 ActRII的内吞作用,降低细胞膜上的 Act-RII受体表达,抑制 Activin信号传导。虽然 ARIP1,2在分子结构和作用方式上不同,但其在细胞内均属于信号传导的负调控因子。尽管我们前期报道了ARIP1,2在脑组织中均有表达,但其在神经细胞中的作用等问题,仍然缺乏研究资料。

本研究进一步揭示,ARIP1,2可以同时在神经细胞内表达,而且 LPS可以促进二者表达升高。但同时我们又发现,ARIP1,2在细胞内介导信号传导存在差异,尽管 ARIP1,2都可以抑制激活素 A诱导的特异基因转录,但 ARIP1还可以抑制 Smad3诱导的基因转录,而 ARIP2则不能改变 Smad3诱导的基因转录活性。

综上所述,尽管 ARIP1,2可以同时在神经细胞中表达,但其介导细胞内信号传导的差异又进一步提示二者可能存在生物学作用的差异,但其差异的意义还有待进一步研究。

[1]Kamamaru C,Yasuda H,Fujita T.Involvement of smad proteins in TGF-beta and activin A-induced apoptosis and growth inhibition of liver cells[J].Hepatol Res,2002,23:211-219.

[2]Thomsen G,Woolf T,Whitman M,et al.Activins are expressed early in Xenopusembryogenesisand can induce axial mesoderm and anterior structures[J].Cell,1990,63:485-493.

[3]方 琳,柳忠辉,刘永茂,等.激活素促进鸡胚神经节神经突起生长作用[J].动物学杂志,2006,41(6):23-28.

[4]Shoji H,Tsuchida K,Kishi H,et al.Identification and characterization of a PDZ protein that interacts with activin types II receptors[J].J Bol Chem,2000,275:5485-5492.

[5]Matsuzaki T,Hanai S,Kishi H,et al.Regulation of endocytosisi of activin type II receptors by a novel PDZ protein through Ral/Ral-binding protein 1-dependent pathway[J].JBiol Chem,2002,277:19008-19018.

[6]Liu ZH,Tsuchida K,Matsuzaki T,et al.Characterization of isoforms of activin receptor-interacting protein 2 that augment activin signaling[J].J Endocrinol,2006,189:409-421.

[7]刘海岩,葛敬岩,陈芳芳,等.激活素受体相互作用蛋白 1在小鼠组织中的表达与分布[J].动物学杂志,2008,43(1):26-30.

[8]刘海岩,陈芳芳,高振平,等.ARIP1,2 mRNA及其蛋白在小鼠脑组织表达和分布的比较研究[J].中风与神经疾病杂志,2008,25(6):663-665.