载药纳米材料治疗骨缺损或骨缺损伴骨髓炎的研究进展

弓家弘 王静成 王大新

载药纳米材料治疗骨缺损或骨缺损伴骨髓炎的研究进展

弓家弘 王静成 王大新

1 骨髓炎与骨缺损的临床治疗困境

骨髓炎是临床上一种严重的骨感染性疾病，急性骨髓炎死亡率很高，近年来由于抗生素的应用死亡率已明显下降，但由于诊断不及时多可转化为慢性[1]。骨髓炎可分为血源性骨髓炎与创伤性骨髓炎。随着经济和卫生状况的改善，血源性骨髓炎的发生率显著降低。目前，创伤性骨髓炎已成为骨科感染的最主要病种[2]。

骨髓炎常规抗生素静滴治疗效果不佳，而且骨髓炎手术治疗失败率高，复发率高[2]。在创伤性骨髓炎中，有时创伤会造成大面积骨缺损，这使本来难以治疗的骨髓炎变得更为棘手。为了彻底治愈骨髓炎，并促进骨组织的重建，许多学者都进行了不同的尝试。

临床上治疗慢性骨髓炎的常用方法是庆大霉素—骨水泥珠链填塞法，但由于骨水泥珠链不能降解吸收，多需二次手术取出，且有周围机化包裹病原菌的可能[2]。而且在拔出珠链后，由于珠链本身不能降解亦无骨诱导活性，会残留大量骨腔，这些骨腔往往还需二次手术植骨。

骨组织重建的方法应根据缺损大小来决定。对于胫骨缺损来说，小于8 cm的缺损可采用后外侧松质骨移植，大于8 cm的缺损则需带血管腓骨移植来进行治疗。近年来，也有使用游离肌瓣移植或松质骨移植修复大于8 cm缺损的。但不论松质骨移植或是使用肋骨、腓骨移植，患者都需要进行多次手术，增加患者的痛苦，供体可能难以提供足够的骨量。也有学者提出使用异体骨修复骨缺损，但异体移植骨虽然预先经过化学、冷冻或射线处理等措施来抑制免疫反应，但仍具有一定的抗原性[3]。其他材料，如金属、陶瓷、高分子等替代材料也同骨水泥链一样难以被机体吸收降解，它们不能参与人体新陈代谢，长期滞留于体内妨碍骨组织的改建和完全修复，因而远期效果欠佳。

另外，在骨缺损并发骨髓炎时，有些大的创口即使没有感染，也有细菌污染存在，进行骨移植易导致感染[2]。因此大面积骨缺损时，多不宜进行一期骨移植手术和闭合伤口。前期手术多采用开放性骨移植或需等创腔壁有良好的肉芽组织覆盖后再进行手术。此法可勉强处理一些骨髓炎伴骨缺损病例，但不能达到一期闭合创口，创口最终形成巨大致密纤维瘢痕。

由于上述诸多困难，使学者们纷纷寻找一种治疗骨髓炎合并骨缺损的更有效、便捷、减轻病人痛苦的方法。

2 载药纳米材料的优势

2.1 纳米替代材料本身的优势

纳米材料增加了材料表面的粗糙度，减少了表面的大小及孔隙的直径，使材料的溶解性得以提高，生物降解性好。增加了材料表面的亲水性，可以吸附更多的细胞，提高蛋白质的吸附作用，进而使细胞和生物材料之间发生交联，提高材料的组织相容性[3]。

上世纪70年代，有学者发现羟基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）是人体骨骼的主要无机成分[4]，宽约2～5 nm，长约50 nm。纳米羟基磷灰石（nano-Hydroxyapatite，nHA）在一定程度上模仿了骨骼的超微结构，植入体内的效果相当于自体骨移植，且又避免了损伤自身器官。如果加入胶原及其他诱导骨生长的因子，则不失为一种优良的骨替代材料。Logroscino等[5]用单纯nHA胶原材料与普通HA材料进行了兔骨缺损的实验对比，证实了nHA材料的良好生物学特性。

纳米级骨材料具有如下优点：①良好的生物相容性，无免疫排斥反应，无毒；②与无机骨基质成分相近，可与宿主骨直接愈合；③良好的机械性能及化学稳定性，在体内能长期稳定地行使骨组织功能，成骨较快，抗腐蚀性较好，耐磨性较强；④来源充足，可高压消毒，储存方便[6]。

2.2 载药的必要性

由于创伤性骨髓炎具有很大的感染风险，多不能一期手术植骨，并需要大量抗生素预防治疗，会增加病人痛苦和经济负担。而骨髓炎清创后亦很难保证无菌，有很大的感染风险，同样不能一期植骨或只能开放性植骨。在以上两种情况下，虽然仿生纳米骨有良好的组织相容性，但若单纯纳米材料植入效果往往不佳。有学者考虑将抗生素加入纳米骨中，依靠纳米材料的特性，既可以保证药物的均匀分布，又可以达到药物在体内的缓释效果。汤善华等[7－10]和Koort等[11]都制备出了载药纳米材料，并进行了动物实验。李云飞等[12]还制作了兔的骨髓炎模型，并将研制成的载药纳米骨一期植入兔骨中，取得了良好的治疗效果，展示了纳米材料应用的广阔前景。

3 纳米仿生骨治疗骨髓炎或骨缺损的研究方法

3.1 纳米材料的设计与制备

3.1.1 基本纳米骨组织的制备

研究者们大都选用nHA作为骨替代材料的主要成分，是因为nHA具有与人体骨无机成分相似、组织相容性好等优点。而实验用的nHA多见三种形制：纳米级的HA晶粒、nHA胶原复合材料与nHA酰胺66（Polyamide 66，PA66）复合材料。肖建德等[6]介绍了将nHA制成仿生陶瓷的方法，即以CaPO3溶解、凝胶化、固化低温热处理后得到纳米HA粒子，再加入Si3N4与β-SiC后成型烧结而成。而田晓滨等[13]用nHA晶粒（20～550 nm）与磷酸钙混合制成了可塑性的骨浆。汤善华等[7-10]则通过nHA粉与庆大霉素混合制成了纳米骨药粒。用nHA晶粒制作替代材料较为方便，且易于塑形，便于在纳米骨中加药或其他因子。但由于缺乏胶原，其成型后不能形成松质骨样的孔隙，因此在组织相容性与吸收率上还有所欠缺。

更常用的是nHA胶原复合材料（n-HA/collagen，nHAC），对于nHA胶原复合材料的制备，鲜思平等[14]进行了详细的综述，大致可有：pH控制的自组装双亲缩氨酸分子重现细胞外基质纳米机构纤维支架法、交替沉淀法、滴定共沉淀法和仿体内骨胶原矿化法等。这些方法制备的nHA胶原复合材料，不论在组成成份还是在超微结构上都非常类似自然骨，由于胶原的存在，成骨细胞增殖、活化，纤维基质迅速转变成骨传导的基质。骨岛中有骨细胞，骨形成活跃的地方有大量的成骨细胞，植入物降解和骨替代的过程与骨的改建过程相似[14]，因此nHA胶原复合材料有合适的降解吸收率和良好的组织相容性。但nHA胶原复合材料不易添加其他活性成份，实验中多采用已成型的材料，可塑性不佳。而张超等[15]制得了nHA胶原复合骨的冻干粉并进行了塑形。陈鹏等[16]更是用真空吸附法在nHA胶原复合材料中加入了克林霉素，这说明nHA胶原复合材料在添加活性成份与可塑性方面还有很大发展空间。

nHA/PA66是由nHA晶粉与PA66混合制成[17]，可看作是单纯使用nHA晶粒的改良型材料。实验证实，PA66具有良好的组织相容性，在体内的降解速率适中，对人体无毒副作用[17]。加入了PA66的nHA可以提高替代材料的韧性，克服原nHA材料性质脆、降解慢的缺点，但nHA/PA66复合材料在其制作过程中加药或其他活性成分较困难。

3.1.2 纳米人工骨的添加成分

单纯的nHA制成的纳米骨有不足之处：①脆性大、韧性低，不能用于负重部位骨缺损的修复[14]。②在体内降解速度过慢。刘新晖等[18－19]使用单纯nHAC植入做对照组，12周后仍能观察到植入物与宿主骨的界限，周边仅有少量纤维骨痂形成，大部分材料仍未降解；张超等[15]用nHA/PA66做对照，12周后仍未达到骨连接；孟纯阳等[20]使用仿真程度很高的网孔nHA/PA66但未添加任何其他成份，需16周方可修复骨缺损。③实验证实，微米级的HA只有骨引导作用而无骨诱导作用[17]，纳米级HA虽然具有一定的骨诱导作用，但其诱导能力不强，虽然Zambonin等[21]通过实验证明成骨细胞在纳米级HA材料上相对微米级的HA上有更强的活性，但单纯nHA的作用有限，还不能说明其具有促骨生成的作用。Zambonin等[21]在成品材料中加入了生长因子以促进成骨细胞活性，但并不能在较短时间内修复大面积骨缺损。④不论是预防感染或是在感染风险下植骨，单纯nHA材料都不能起到很好的效果。

近年来，研究者们尝试将其他具有生物活性或药性的成份引入纳米骨材料，具体有：

①增加材料骨诱导与促骨生成作用的成份，包括加入成骨细胞[22]、骨髓间充质细胞[18－19，23]、带有产生骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）质粒的真核载体[13，24]、产生血管内皮细胞因子165的真核载体[13]等等。另有直接在材料中加入BMP与红骨髓的研究[25]，虽然活性不高，促骨生成作用时间持续不长，但成本低且较简便。Zambonin等[21]加入了胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor 1，IGF-1），体外实验证实对成骨细胞有促进作用。Jensen等[26]添加了骨形成蛋白（Osteogenic Protein 1，OP-1），也取得了良好效果。

②改善纳米骨性质的无机、有机成分。无机成分包括：增加材料组织相容性与硬度的碳纳米管[6，27]；使材料具有可塑性的磷酸钙粉[13]；增加硬度的Si3N4与β-SiC[6]；帮助代谢、造血与骨骼恢复的无机金属成分，如铁[28]等。有机成分则包括：增加材料韧性的纤维材料[18，27]与PA66[15，17，20]等。

这些成分中有很重要的一类即多聚化合物。PA66是国内较为常用的一种多聚化合物，Wei等[29]研究了nHA与聚酰胺在骨替代材料中的配比，认为聚酰胺可增加纳米骨的承重能力。另有报道认为，加入聚乳酸可增强HA复合材料的吸收降解能力与组织相容性[30]；加入聚乙烯丙烯酸可增强材料的力学性能[31]；加入聚乙烯醇可使nHA形成胶冻状[32]。

③治疗骨髓炎并预防感染的成份多为抗生素，有常用的庆大霉素[7－10，33]，治疗厌氧菌感染的强力抗生素克林霉素[16]以及对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌效果优秀的万古霉素[9]和对普通金黄色葡萄球菌效果优秀的环丙沙星[11，34]等。

3.1.3 纳米人工骨的形制

纳米人工骨可制成片状、圆柱状、块状、药粒等形状。田晓滨等[13]制成的纳米骨浆呈无定形状态，具有可注射性。Stallmann等[33]制备了纳米骨水泥，还在其中加入了nLF1-11和庆大霉素。Xu等[32]制成了nHA/PVA水凝胶，柔软而具有可塑性，可用于非承受部位的骨缺损修复或作为修补缺损的辅助性材料。由于临床病变多种多样，只有可塑性强的替代材料才能适用多种情况。因此，可塑性也是纳米人工骨的一个发展方向。有许多学者采用粉剂体外预制成一定的形状后再植入实验动物体内，也使材料具有一定的可塑性。Qiu等[35]制作了微球形的nHA（直径30～50 nm），汤善华等[7-10]也制作出nHA微球，认为微球形的nHA更有利于药物及其他添加成分的均匀分布与缓释。

另外纳米人工骨的孔径大小与孔隙率也是影响正常骨组织长入与材料降解吸收的重要方面。多孔结构具有较高的比表面积，可提供较大的表面积和空间，不但能促进细胞的黏附生长，而且有利于细胞外基质的沉积以及营养和氧气的进入及代谢产物的排出，也有利于血管和神经的长入[20]。孔径与孔隙率尚无统一标准，有报道认为孔径＜100 μm不利于骨细胞长入，因此将孔隙大小保持在100～1 000 μm之间较为合适[36]。孔隙率的大小须根据材料的用途来决定，因为孔隙率增大有利于提高比表面积，便于细胞长入，但降低了材料的力学强度。考虑到吸收与强度之间的平衡，作为修复骨缺损的纳米骨材料孔率设计在50%～80%之间，这同人体松质骨的孔隙率相当，具有良好的生物活性。郑谦等[17]通过在纳米材料表面嵌入NaCl的方法，造成了200～400 μm的孔径。这种做法只能确保材料表面一层的降解并与自体骨接合，但是其内部的实心结构使得材料进一步降解非常困难。Mobini等[37]则先用HA、明胶、NaCl制成混合物，然后成型、加热、去盐制成多孔材料（100～200 μm），材料整体都呈疏松结构，性状良好。Ignjatovic等[30]也采取了类似的方法。孟纯阳等[17]采用了有机材料挥发法制出了均一的孔洞，但其采用的有机材料具有一定的细胞毒性，可能影响材料的植入效果。

3.2 纳米骨材料性质的检测

刘新晖等[38]测验了纳米相HA胶原复合材料的组织相容性；谢鑫荟等[39]研究了钛合金表面涂纳米HA的人骨髓基质干细胞相容性，都证明了纳米骨复合材料与骨髓基质干细胞或成骨细胞有良好的相容性。Huang等[40]用热相分离法制备了nHA复合材料支架，检测了其与兔骨髓基质干细胞的相容性。郑谦等[17]在制成nHA/PA66替代材料后检测了其抗压强度、弯曲强度、弹性模量等力学性质。对于使用载药纳米骨治疗及预防骨髓炎，汤善华等[7－10]分别进行了加入抗生素的抑菌试验与载药纳米粒的抑菌试验，而陈鹏等[16]与李云飞等[12]只进行了成品药粒的体外抑菌试验，方法大体相同。

3.3 动物模型的制作

3.3.1 骨缺损模型的制作

孟纯阳等[20]将新西兰大耳白兔的桡骨在远端2.5 cm处锯断桡骨。李志跃等[41]直接用锐剪剪断桡骨，再向近侧推进1.5 cm锯断，连同附着的骨膜一起去除该段1.5 cm的桡骨，植入纳米材料或进行相关处理后，再逐层闭合创口，不做内外固定。肖建德等[6]截取青紫兰兔2 cm的桡骨。袁治国等[42]采用家兔，从鹰嘴突下30～40 mm处截除了30 mm的尺骨中段骨干，并对骨端进行蜡封[25]。除桡骨骨缺损模型外，Fukui等[43]将日本白兔的下颌骨钻出直径2 mm深4 mm的小洞作为植入材料的模型。陈鹏等[16]与郝晓光等[22]在兔颅骨上打孔造成骨缺损模型，孔径5～8 mm不等。

以上几种模型制作方法各有利弊，以孟纯阳等[20]制作的骨缺损模型最为实用。因为颅骨缺损模型虽然有手术操作简单、缺损处不受力、活动频率低宜于骨生长重构等优点，但临床上四肢处的骨缺损更为常见，四肢处的外伤、骨髓炎等都可以造成大面积的骨缺损。另外，虽然下肢受力较多、上肢活动频繁等看似不利于骨的生长重构，但功能状态下的四肢活动是骨恢复生长重新构型的重要条件，适度承重与活动可能有利于骨缺损的修复。

还有不少学者使用鼠作为实验对象，Ignjatovic等[30]使用了Balb/c小鼠，将纳米材料植入其腹膜中，虽与植入骨中有一定差距，但可大体了解材料植入体内的情况。Lewandrowski等[44]则使用了SD大鼠作为实验对象，他们采用了在胫骨前内侧干骺端造成直径3 mm孔洞的方法制作了大鼠的骨移植模型。鼠作为实验对象的优点：①价格便宜；②操作便利；③饲养、搬运方便，易于管理。但也存在一些缺点：①鼠并非国际公认的制作骨缺损或骨髓炎的实验动物，缺乏统一的量化指标；②鼠的体形较小，骨骼等器官结构亦很微小，需要非常精细的手术操作；③鼠的寿命较短，这与骨损伤所需的较长恢复期有一定矛盾；④鼠抵抗外来损伤刺激的能力较差，在实验中或实验后的恢复期中容易死亡。

刘新晖等[18]使用中国靑山羊为实验对象，截取胫骨40 mm制成骨缺损模型。郑谦等[17]使用杂种犬，造成下颌骨下缘箱状缺损（15 mm×10 mm×5 mm）。Jensen等[26]使用了拉布拉多犬，在双侧膝关节的股骨内外侧髁钻取了直径11 mm圆柱形孔洞以植入修复材料。使用这些动物进行实验，优点在于易观察，生理结构和手术操作等拟人性较强，但没有统一的标准，实验过程较为复杂，而且这些动物皆价值不菲。

3.3.2 骨髓炎模型的制作

文献报导较少，以前有过鸡或兔的血源性骨髓炎模型的制作方法。近年来，由于血源性骨髓炎已罕有发病，故此模型现已弃用。创伤性骨髓炎发病率的增加，使许多学者开始设计制作动物的创伤性骨髓炎模型。李云飞等[12，45]采用胫骨干骺端注射5%鱼肝油酸钠和MRSA菌种的方法诱导，3周后形成慢性骨髓炎模型。陈鹏等[16]通过在植入载药纳米材料后，向材料表面滴加金黄色葡萄球菌悬浊液的方法，制作了兔的“预防感染”模型。汤善华等[8，10]未使用病原菌，仅通过在兔左股骨外髁开窗植入纳米药粒的方法，检测了纳米药粒在体内的释药情况。Koort等[11]通过骨水泥填充，接种病原菌，填充材料移出，再植入载药材料的方法模拟了临床上骨髓炎治疗并发骨缺损的情况。Stallmann等[33]与Kanellakopoulou等[34]都通过穿孔注入的方法诱发兔的骨髓炎，Kanellakopoulou等[34]还将穿刺针留置兔伤口内一段时间以模拟异物创伤感染的过程。在动物创伤性骨髓炎模型的制作方面，目前还没有统一的标准，上述方法均存在一定的不足。

3.4 模型动物的使用、分组及检测项目

3.4.1 模型动物的使用

制备动物模型后，根据不同要求，可以立即或喂养一段时间使用，如大部分的骨缺损实验都是在制备模型的同时植入纳米骨，而李云飞等[12]为了制作“慢性骨髓炎”模型，在骨中接种细菌后又喂养3周才进行了载药纳米骨的植入实验。预植入的纳米复合材料经预先消毒，并保持新鲜活性状态。固态材料可以切割或压制缺损形状后再植入患处；纳米药粒则可采用填塞法植入；可塑性骨浆、骨水泥等可通过注射器注入缺损处。植入后皆无需内外固定。

3.4.2 动物模型的分组

由于样本增大可以减小抽样误差，但考虑到人力物力等因素，实验个数又不能过多。几组研究所用兔子多在20～50只左右，若采用羊或狗作为实验对象则数目可以稍减。另外若以肢体骨缺损造模时，由于动物双侧肢体的对称性则可将实验动物分为几只或几肢。这样就可以很好地提高效率、节省资金。如孟纯阳等[20]、郝晓光等[22]都采用了一侧实验对侧对照的方法。

具体的分组可分实验组、处理组、对照组、空白组几种。实验组一般应用研究中最完备的复合纳米材料；处理组是比实验组中的材料少去1～2种处理因素，以研究处理因素的独立作用；对照组多采用空白的纳米材料或自异体骨填充治疗以模拟传统的治疗方法；空白组多造出动物模型后则不再进行任何处理或干脆购入动物后单纯喂养不加任何处理。田晓滨等[13]、汤善华等[8，10]都采用了以上完备的4组方案。

3.4.3 动物模型的检测项目

由于载药纳米材料具有局部缓释、局部抑菌作用，故汤善华等[8，10]与陈鹏等[16]测量了模型实验部位骨粉碎后的药物浓度以及该处的细菌培养试验。包括：大体观察、X线片、组织学观察、电镜观察以及愈后骨的三点力学试验。随着实验技术的发展，X线片已发展到了计算机灰度分析[13]；电镜除了观察骨与材料界面相容性外，还可以观察成骨、破骨细胞在材料表面爬行的情况。肖建德等[6]与田晓滨等[13]还测量了血BMP表达与ACP的表达，这两者在血中的高表达皆是骨骼生长、加速愈合的标志。此外，邹海波等[24]通过兔ECT，观察受损修补处的血流情况以判断预后。肖德明等[25]改良了力学试验，增加了轴向压缩与扭转破坏两种测试。合理地分配观察时间点，可以保证实验结果的准确，大多数的研究者都通过预实验来确定观察时间点。

3.5 效果与效果分析

由于纳米载药材料本身具有良好的组织相容性与优秀的药物均缓能力，在各组研究团队加入了促进骨生长长入与加快材料降解的因素后，便展示出了极为优秀的治疗效果，无论是骨髓炎抑或是骨缺损，大都在12周左右取得了明显的效果。这比起以往骨髓炎的经久不愈与骨缺损长达一年的修复期都有了显著的进步。孟纯阳等[20]的实验中，nHA/PA66复合材料植入效果已超过了牛的脱抗原异体骨移植，nHA/ PA66复合材料吸收快，同样时间愈合强度高且无抗原性。而肖德明等[25]则用实验证明了HA复合材料是仅次于自体骨移植的一种治疗骨缺损的适宜方法，其治疗效果可与自体骨移植相媲美，且不会损伤身体其它的组织器官。王科文等[46]更是用nHA胶原复合材料治疗了10余例儿童骨缺损，并取得了较好的效果。这些研究结果无疑预示了纳米材料广阔、光明的发展前景。

4 展望

生命体是复杂的，是按照遗传信息自我复制、自我组装的。事实上，活细胞本身就是一个天然的纳米工厂，细胞中的很多机构单元都是执行某种功能的纳米机器[47]。骨组织由于机构和功能相对简单是最有希望早期获得临床应用的领域之一。现在制成的仿生纳米骨已具有高度的拟真性，再加入促骨生长的因子与抗生素，并制成一定的适宜形状，从而发挥最佳的成骨、抗菌能力，以期更好地治疗骨缺损和骨髓炎。但骨纳米材料研究中仍有一些问题需要解决，而且研究还大都处于实验室及动物实验阶段，离真正地用于临床还有一段距离。但是，目前的多项研究成就已为我们揭示了未来仿生纳米骨应用的美好前景。

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B

1673－0364（2010）01－0056－05

2009年11月30日；

2010年1月8日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.017

225001江苏省扬州市江苏省苏北人民医院骨科。