荧光素酶报告基因在干细胞体内示踪研究中的应用

杜子婧 杨 湄 昝 涛 李青峰

荧光素酶报告基因在干细胞体内示踪研究中的应用

杜子婧 杨 湄 昝 涛 李青峰

活体生物发光技术是一种新兴的成像技术，是利用荧光素酶在活体内的可检测性、可视性和持续表达性，以暗视野CCD[1]（Charge-coupled device，电荷偶联设备）相机系统为基础的一种成像技术，它能有效地对报告基因标记的实验对象进行实时、原位的观测，可在完整的体内环境中快速获得时间、空间的信息。生物发光技术具有非侵入性，可以减少实验动物的数量，减少动物个体差异对实验数据的影响[2－3]。与其他活体成像技术，如磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、正电子成像技术（PET）等相比，活体生物发光技术更加敏感、安全、直观，且操作简单，已被广泛应用于生命科学、医学、药物开发等多领域的研究[4-6]。

1 生物发光成像概述

1.1 荧光素酶报告基因

荧光素酶的种类繁多，其中主要用于研究且广泛使用的是萤火虫荧光素酶（Fluc）[7]。该物质从北美萤火虫体内分离获得，是由550个氨基酸组成的蛋白质[8]，具有较低的的免疫原性[9]，可以在体内长期存在。底物荧光素（D-luciferin），约为280 D的小分子，脂溶性，可在全身分布，不受血脑屏障和胎盘屏障的限制[10－11]。在氧气、Mg2+和ATP的存在下，荧光素酶可与其底物相互作用，发出波长峰值为562 nm的可见光，而在正常体温37℃时，峰值转移到612 nm[12]，超过600 nm的波长可以将体内血红蛋白的吸收作用降到最低，使更多的光可以穿透组织和皮肤而被检测到[13-14]。其他种类的荧光素酶也有不同的应用，来源于细菌的荧光素酶（Lux）用于原核表达系统[15]；海肾荧光素酶（Rluc），在体内的代谢速度较萤火虫荧光素酶快，所发波长在460～540 nm，大部分的光被组织吸收，因此该酶主要用于对前者的对照试验或双标记实验。目前，GFP-Luc、RFP-Luc、Luc-LacZ以及双荧光素酶等融合报告基因被广泛使用。

荧光素酶报告基因标记干细胞有两种方法，一是应用含Luc转基因动物的干细胞移植到正常实验动物体内进行活体示踪；二是应用基因转染技术进行标记。利用病毒载体将荧光素酶报告基因整合到预期观察细胞的染色体上，常用的病毒载体有慢病毒、逆转录酶病毒和腺病毒[16]。其中，慢病毒载体可以长时间稳定表达目的基因，是构建荧光素酶报告基因载体的最佳选择；而用逆转录酶病毒构建的方法在较长时间的培养中发现表达荧光素酶内的能力下降[17]；腺病毒转染不能将报告基因整合到细胞的染色体中，限制了示踪干细胞在体内的存活和扩增[18]。

1.2 成像原理及特点

每一个荧光素酶反应后只产生一个光子，由于散射和吸收的影响，能到达体外且能被检测到的光子量很少，肉眼无法观察，因此需要一套装置来检测光子。该装置主要由3部分组成：低温成像CCD相机、成像暗箱及成像软件。生物发光的特点是不需要激发光，避免了对体内正常细胞的损伤，有利于长期观察各种生物行为；由于动物体自身不会发光，生物发光有极低的背景，检测灵敏度很高，可检测到102数量级的细胞；信号可以定量，从体表的信号水平直接得出发光的细胞数量；可动态观察体内细胞代谢活性及其增殖、存活情况。生物发光成像（Bioluminescent imaging,BLI）输出的为二维图像，使用与定性分析和定量计算，但难以实现光源的准确定位[19]；生物发光断层成像（Bioluminescent tomography，BLT）可获得活体小动物体内发光光源的精确位置信息，弥补了BLI在精确定位上的不足。

2 荧光素酶生物发光成像在干细胞研究领域中的应用

生物发光成像广泛用于细胞凋亡[20]、蛋白质间的相互作用[21]、免疫细胞的迁移[22]、癌症及其药物的研究[23-24]等多领域。最近几年，这种技术开始被用于干细胞的研究中，可在活体内观察干细胞的行为和生物学特性及其转归，可以准确得到活动物体内靶位置的干细胞在各个时间点的生存和分化情况，动态、全面地检测靶细胞在体内的转归过程，加速了干细胞在肿瘤、组织工程等领域中的研究，为干细胞的示踪提供了一个有效的手段。

2.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞（ECs）是一种全能干细胞，具有自我更新和分化成各种类型细胞的能力。Feng等[18]观察EC-TF（三重融合基因标记的胚胎干细胞fluc-mrfp-ttk）移植到裸鼠的心肌，用BLI和PET进行比较监测。BLI信号在1～4周内不断增强，特别是在第2～3周，PET信号逐渐增高，与BLI结果呈相关性，直接表明了ECs在宿主心脏内的存活和增殖。Li等[25]利用双报告基因（Fluc-eGFP）比较4周内hECs（人胚胎干细胞）与hESC-ECs（人胚胎干细胞来源的内皮细胞）在SCID小鼠体内的转归。BLI信号显示在移植的第2天，hESC-ECs-FLuc-eGFP表现了较强的信号，在随后的时间内逐渐减少，说明移植后的ESC-ECs细胞快速死亡；而hECs-FLuc-eGFP表现了不断增强的信号，形态学检测与BLI结果一致，说明ECs在体内快速扩增。BLI可用于纵向监测胚胎干细胞在实验动物活体内的生存和增殖。

2.2 骨髓来源干细胞

2.2.1 造血干细胞

对造血干细胞的研究已有多年的历史，常规的实验需要牺牲大量的实验动物来观察不同时间点的造血干细胞在体内的转归，无法达到实时纵向监测移植物在活体内的动态迁移和归巢的全过程，而活体示踪的方法可以动态、长期的观察造血干细胞。Cao等[26]用荧光素酶标记的造血干细胞移植到辐射处理的小鼠体内，早期在脾脏和骨髓中发现了不连续的点状发光，而后点状发光不断扩大遍布全身。在该实验中，BLI提供了一个有力的方法评价造血干细胞在体内的生物学行为，监测造血干细胞在活体内的迁移与分布的过程。

2.2.2 非造血干细胞

骨髓来源的干细胞具有多向分化潜能性，可以分化成骨、软骨、成肌细胞、神经等[27-33]。Hara等[34]利用这一技术实时监测MSCs在体内的转归。在损伤部位，动脉注射途径产生的信号比肌肉注射途径高4～5倍，虽然动脉途径移植的初期会有MSCs在肺部聚集的情况，但是在第2天基本消失。生物成像结果表明，动脉注射是MSCs移植的最佳途径。Inoue等[35]利用转基因技术，将Luc基因转入Lewis大鼠中，从中提取MSCsLuc和BMCsLuc，分别将两种细胞移植到人工真皮上，修补头部全层皮肤缺损的糖尿病大鼠，通过BLI观察到MSCs停留在损伤部位的时间长于BMCs，而这一现象与组织学显示损伤部位的愈合和血管数量呈正相关。Laura等[36]分别将hUVECLucGFP(人内皮细胞)和hUVECLucGFP与hMSCs的混合物（4∶1）皮下注射到裸小鼠的腹侧，观察血管的形成过程。在细胞移植的第1天，含有hMSCs的荧光素酶活性明显高于不含hMSCs，随即光子信号减弱，而在14 d时信号逐渐增强，该过程可能与血管网络建立和整合到血管床有关。在120 d的观察中，含有hMSCs的信号稳定，高于不含hMSCs的信号，这一结果与形成功能性血管呈正相关。Koen等[37]利用活体示踪比较Luc/GFP转基因小鼠不同的干细胞在心肌梗塞中的作用。BLI的数据显示，移植后的第2天，在移植区域有较强的信号，说明了MSCs、ASCs（Adipose stromal cells）心肌内移植成功，随后信号明显减弱，4～5周后与背景水平一致。利用BLI技术验证了在心脏区域移植的细胞没有长时间的生存能力，同时该实验认为GFP可能引起免疫反应，从而影响了移植细胞在心脏区域的存活[38－39]。在该实验中带有荧光素酶基因的细胞对机体影响小，安全性较好，有利于长时间的观察细胞生物学行为。Akimoto等[40]用Luc/GFP转基因小鼠的骨髓来源细胞体外培养，移植到经过辐射处理的小鼠体内，利用LPS直接注射到海马区域诱导炎症，生理盐水作为对照组。在整个实验过程中FLI的信号强度无明显强弱改变，相对于对照组无差异，而BLI实验组的信号明显高于对照组，且与免疫组化结果一致。说明BLI优于FLI，可用于检测到更深部的信号，是一种更好的示踪方法。

2.3 神经祖细胞、神经干细胞

神经干细胞具有迁移能力，可分化成神经细胞、神经胶质细胞、少突神经胶质细胞，同时也可作为细胞载体，传送治疗因子。Shah等[41]用Gil36-RL（GFP-RLuc）建立小鼠恶性胶质瘤模型，将NPC-FL-sTRAILs移植到对侧脑实质，观察NPC（神经祖细胞）在体内的迁移状况和肿瘤的大小。BLI的结果提示，NPC跨过胼胝体移动到肿瘤部位，且胶质瘤区信号范围明显缩小。Sher等[42]利用生物发光成像技术观察Olig2-NSCs（神经干细胞）移植到Cuprizone模型小鼠胼胝体内，2周内BLI信号迅速下降，50 d后Olig2-NSCs信号仅为开始时的10%，表明大部分的细胞死亡，仅有少量的细胞存活。这两个实验说明，BLI可以通过监测发光点的范围、光强度而直观地获得标记的细胞在体内的生存、分布、迁移和增殖等生物学信息。

2.4 肌肉干细胞

在肌肉干细胞的研究方面，Sacco等[43]将表达荧光素酶的MuSC（肌肉干细胞）和肌肉细胞移植到清空内源性卫星细胞并且肌肉损伤的NOD/SCID小鼠体内。BLI结果表明，移植MuSC产生较强的信号，而移植肌肉细胞则几乎检测不到信号；组织学证实，MuSC能够在体内增殖、分化、修复肌肉损伤。结果表明，BLI的信号强度与供者来源的肌细胞数量呈正相关，BLI是一种可以量化供体细胞，动态示踪供体细胞在活体内增殖的理想工具。

总之，干细胞移植在骨缺损、脑血管疾病、神经系统疾病、血液病、缺血性疾病、肌肉损伤修复等方面[44-46]都有着广阔的应用前景，建立一种干细胞活体示踪方法对了解其体内生物学行为极其重要。生物发光成像所具有的特点，使它能实时动态观测干细胞的转归，评价其安全性，分析选择适合于不同组织修复的干细胞以及移植生物材料的筛选[47－48]，为摸索最佳的干细胞移植途径、研究干细胞在体内复杂的生物过程提供了依据。同时，生物发光成像技术也存在一些需要改进的地方，如进一步优化荧光素酶报告基因，以减少光波在体内的吸收和散射；增加荧光素酶的组织特异性，增强在体内示踪的敏感性，使生物发光成像能更广泛地、更深层次地应用于干细胞领域的研究。

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Q786

B

1673－0364（2010）01－0052－04

2009年11月17日；

2010年1月6日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.016

上海市晨光计划（09CG14），上海市科委科技人才计划（08XD14025）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。